[发明专利]一种鼠李糖苷酶突变体及其制备方法和应用

说明书

一种鼠李糖苷酶突变体及其制备方法和应用，本发明涉及生物医药技术领域，包括将氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的鼠李糖苷酶的突变位点突变为丙氨酸得到的突变体，所述突变位点为第512位的色氨酸、第570位的组氨酸和第579位的赖氨酸中两个以上的组合。本发明的一种鼠李糖苷酶突变体，通过定点突变技术构建α‑L‑鼠李糖苷酶TpeRha的组合突变体，催化转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物，酶解时间短，转化率高。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种鼠李糖苷酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

淫羊藿是小檗科淫羊藿属植物，是我国药典收载的传统中药，具有益精气、坚筋骨、补腰膝、强心力等功效，其主要活性成分是含有2-3个糖基的淫羊藿黄酮苷，淫羊藿黄酮苷具有抗癌、抗骨质疏松、抗衰老、免疫调节功能和补肾阳作用等功效。大量研究显示，朝藿定C、淫羊藿苷等淫羊藿黄酮原生苷在小肠吸收较差，其主要是以肠道代谢产物（次级苷或苷元）的形式被吸收而发挥疗效。因此，对淫羊藿黄酮苷进行稳定可控的水解，实现淫羊藿黄酮苷的有效生物转化，对于加强药物合成、增加生物利用度以提高药效发挥上具有重要意义。淫羊藿次苷Ⅰ是淫羊藿黄酮次级苷中的高活性物质，其通过菌群调节展示了潜在的增强宿主免疫功能和抗癌活性，具备很好的抗癌药物开发前景。但是，淫羊藿次苷Ⅰ在淫羊藿中含量极低，随着其活性功能不断被挖掘，其市场需求将越来越大。传统植物提取方法因其含量极低，后期纯化难度高，而淫羊藿提取物中含量相对较高是原生苷，如朝藿定C（占淫羊藿总黄酮的20.8%）和淫羊藿苷（占淫羊藿总黄酮的21.9%），以原生苷作为前体物质，利用α-L-鼠李糖苷酶进行淫羊藿次苷Ⅰ的制备是目前最有效的制备方法。

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是一类具有广阔应用前景的糖苷水解酶，在植物、动物和微生物中广泛存在，能够将以醇羟基和半缩醛反应形成的糖苷键以外切或内切的方式断裂，在生物体中糖缀合物以及糖的合成和水解的过程中起到很重要的作用。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药等行业都具有广泛的应用价值，已有大量报道其可以有效地定向水解含有鼠李糖苷的天然活性物质或天然药物，如人参皂苷、柚皮苷、橙皮苷和芦丁等，提高原有物质的生物活性和生物利用度，是工业生产中常用的水解酶类。

然而，α-L-鼠李糖苷酶在进行规模化应用时仍然存在较大的技术壁垒，天然的α-L-鼠李糖苷酶活力不足，且其反应环境往往难以满足天然酶的最优条件。随着分子生物学、基因工程等相关技术逐渐成熟，对蛋白序列进行编辑与修改，可以加强酶催化机理的解读以及指导酶的设计。蛋白质工程理性设计是以定点突变技术为主要手段，根据对蛋白质结构与功能关系地了解，有目的地设计改造蛋白质，使其性能达到预期效果。目前，已有大量研究成功利用理性设计技术对天然酶的催化活性、底物特异性、热稳定性以及酶的别构效应等进行改造。然而，理性设计方法需要对酶的三维结构以及结构与功能的相互关系有较深入的了解。随着计算生物学的发展，计算机辅助设计指导酶改造的方法日趋成熟。利用计算机模拟的方法，建立酶的三维结构模型，分析酶与底物的构象关系，快速定位与催化反应相关的区域，缩小突变库容量，高效获得相关靶点，为蛋白质工程改造提供指导。

专利号为CN201710448315.6，名称为一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法的中国专利，其通过α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成制备淫羊藿苷元，具有较高淫羊藿苷元转化率，但是其中的淫羊藿次苷Ⅰ含量未知。专利号为CN201710332977.7，名称为一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，由耐热α-L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶组成的双酶体系协同转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷生成淫羊藿苷元，也无法高效催化转化得到淫羊藿次苷Ⅰ。因此，采用定点突变技术对α-L-鼠李糖苷酶TpeRha进行理性设计获得具备水解淫羊藿苷生成淫羊藿次苷Ⅰ的高效的鼠李糖苷酶突变体是一个具备意义的研究方向。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种鼠李糖苷酶突变体，用于制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物，转化率高。