[发明专利]一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法

权利要求书

1.一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法，包括以下步骤：

1)使用ImageJ软件对采集的smFRET原始图像进行预处理并提取信号点位置，包括：

1a)预处理：

使用“Make Substack”将smFRET原始图像按受体和供体通道分别提取为acceptor.tif和donor.tif；分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Subtract Background”处理以降低背景信号对真实信号强度的影响，并另存为“Image Sequence”；

1b)提取信号点位置：

首先，分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Z project”处理，将每个像素在所有帧中最大的信号强度赋值给该像素，分别得到一张2D的受体通道和供体通道的Z投影图；

接着，使用“Find Edges”处理供体通道的Z投影图以突出信号变化强烈的边界信号而降低在空间上无明显信号强度变化的背景区域信号强度，然后使用“Threshold”设置阈值选择适当强度范围内的信号，再使用“Analyze Particles”对选中的信号点进行分析，生成一张仅保留目标信号点而其他像素值为0的Mask图；对得到的Mask图做“Find Maxima”处理，得到每个目标信号点的位置坐标，将得到的坐标列表另存为pos.csv文件；

同时，对供体通道和受体通道的Z投影图分别做“Subtract Background”处理，分别另存为donor_ref.tif和acceptor_ref.tif；

2)使用MATLAB算法提取信号点强度信息并进行FRET状态分析，包括：

2a)提取信号点强度信息：

以donor_ref.tif作为参考图，对pos.csv中的供体信号点位置坐标进行校正，然后以校正后的信号点位置为中心，计算相应供体信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹；以acceptor_ref.tif作为参考图，在校正后的供体信号点位置周围寻找受体信号点最强的坐标位置，以该位置为中心，计算其周围的受体信号强度平均值，得到与每个供体信号点对应的受体信号的强度随时间的变化轨迹；

2b)FRET状态分析：

对供体信号强度进行阶梯函数形式的拟合，在该拟合下，一个step代表一个被激发的供体荧光分子，因此拟合结果中仅有一个step的信号是单分子供体信号；将供体信号为单分子的信号点用于后续分析：对单分子荧光被激发的时间区间内的信号强度使用公式(1)计算FRET效率：

其中，I_A代表受体信号强度，I_D代表供体信号强度；

最后对所有单分子信号点的FRET效率均值进行统计分析，绘制直方图观察分布情况。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中做“Subtract Background”处理时rolling ball radius为10～50pixels。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中做“Subtract Background”处理时rolling ball radius＝30pixels。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)对单张图进行分步操作，或者集成在一个ImageJ Macro中运行。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1b)中使用“Analyze Particles”对选中的信号点进行分析时，设定size＝9-49，circularity＝0.90-1.00。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2a)中，以donor_ref.tif作为参考图，在pos.csv中的坐标位置周围3*3像素范围内寻找信号点最强的坐标位置，从而对供体信号点位置进行校正；以校正后的信号点位置为中心，计算其周围5*5像素范围内的信号强度平均值，得到相应供体信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹。