[发明专利]一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法，该试剂盒包括R1、R2和R3，R1包括DNB制备缓冲液，R2包括DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液，R3包括DNB终止缓冲液。该方法包括dsDNA文库与DNB制备缓冲液混匀后高温变性及低温退火；退火产物与DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液混匀，低温下反应；DNB终止缓冲液终止反应。该试剂盒和方法创造性地将单链环化和滚环扩增过程放在一个步骤进行反应，且中间不用酶切消化和纯化，大大节省了操作步骤和时间。

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法。

背景技术

近年来快速发展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。

目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原微生物呈现多样化和复杂化的发展趋势。重症急性呼吸综合征(SARS)、新型冠状病毒肺炎、新变异型克雅病、H7N9禽流感等新发感染性疾病不断出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原微生物又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

随着高通量测序在临床应用的辅助诊断重要性的提升，如何降低测序成本是一个很关键的问题。华大智造(MGI)不断推出更高测序通量的测序仪，测序成本不断降低，相继推出MGI-200、MGI-2000和T7测序仪，其中T7测序仪是目前市场上测序通量最高和测序成本最低的测序仪，使得华大智造的测序仪在市场上的应用越来越多。

MGI平台在上机测序之前需要进行DNA纳米球（DNANanoball，DNB）的制备。目前，制备DNA纳米球的流程（如图1）是先把dsDNA文库进行单链环化、酶切消化、磁珠纯化、变性退火、滚环扩增等过程，整个操作需要2小时以上，整个操作流程多、时间长。

鉴于临床上对时效性的迫切需求，因此，仍需要对现有技术进行改进，以改善现有流程多、时间长的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法，使得整个DNB制备的过程从2小时降低到0.5小时，大大地缩短了上机前的操作时间。

为实现上述目的，本发明的一个方面是提供一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒，包括试剂R1、R2和R3，

所述R1包括DNB制备缓冲液；

所述R2包括DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液；

所述R3包括DNB终止缓冲液。

本发明的DNB制备缓冲液包括50-80mM乙酸钾、10-20mM乙酸镁、20-50mMTris-乙酸、0.1-0.3mg/mlBSA、1-10mMDTT、1-5μM寡聚核苷酸1、1-5μM寡聚核苷酸2、0.01-1μM寡聚核苷酸3、1-5μM寡聚核苷酸4。

优选的是，所述寡聚核苷酸1其序列如SEQIDNO.1所示：5´-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3´；所述寡聚核苷酸2其序列如SEQIDNO.2所示：5´-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3´；所述寡聚核苷酸3其序列如SEQIDNO.3所示：5´-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3´；所述寡聚核苷酸4其序列如SEQIDNO.4所示：5´-CAACTCCTTGGCTCACA-3´。

更优选的是，所述四个寡聚核苷酸的3´端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰。