[发明专利]一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法

说明书

本发明提供一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法，所述方法采用Lysing Matrix E管和溶菌酶、GB裂解液等配合使用用于样本处理，该方法对样本需求量低、流程便捷、节省时间，同时具有高检出率和客观性，利于辅助临床诊断。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法。

背景技术

过去20年里，全球每年约有1500万人死于传染病(福奇和莫伦斯)。世界卫生组织于2019年发布了全球卫生十大威胁，其中6个与传染病有关。新出现和再次出现的致命病原体包括经典病原体的传播以及耐多药病原体(如多药耐药肺炎克雷伯菌、淋病奈瑟菌、结核分枝杆菌等)，强调精确诊断和有效治疗传染病所面临的日益严峻的挑战。

临床实验室中病原体的鉴定所依赖的传统培养诊断技术(如培养、核酸扩增试验、免疫测定、等)和相对较新的技术，如16S rRNA(16S rRNA)基因测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS),这些方法有明显的优点和局限性，在处理复杂感染时，它们往往暴露出一些弱点，如繁琐、耗时和诊断准确性有限，导致延误或漏诊。据报道，40％的肠道感染(Thomas等，2015年)、约50％的血液感染(BSI)(Fenollar和RaoμLt,2007年)和50％以上的中枢神经系统(CNS)感染(Glaser等2006)的病原学仍然未知。这些未确诊的病例迫使医生开出经验性广谱抗生素治疗，这将大大增加出现耐多药细菌的风险，并有可能增加严重感染患者的死亡率。

下一代测序(NGS)技术为诊断传染病打开了另一扇窗口。新一代宏基因组测序(mNGS)已成为一种有前途的单一、通用病原体检测方法，用于传染病诊断。这种方法允许细菌、真菌、寄生虫和病毒的鉴定和基因组特征，而不需要事先从临床标本获得培养的结果。临床样本的NGS研究或临床实验室涉及许多步骤包括核酸提取、DNA和/或RNA浓缩、文库制备、PCR扩增、测序和生物信息分析。实验室使用的核酸提取方法类型是影响结果的主要因素之一，不同病原体核酸释放量可能不同。例如，分枝杆菌需要剧烈的细胞破碎以有效的溶解细胞壁以释放核酸，不同的标本类型需要不同的提取方法，有效的提取方法是实现一个样本真正无偏移测序的关键步骤。

真菌的细胞壁由多种多糖、蛋白质和糖蛋白组成。多糖约占壁的80％，而蛋白质占20％，同时也有少量的脂质和蜡，这些物质的存在可以避免干燥。真菌细胞壁一般有三层：最外层由糖蛋白和葡聚糖或甘露聚糖组成，第二层是β-1,3葡聚糖，最内层由几丁质组成。细胞壁的结构在不同的类群之间是不同的：以上所列的组分比例会存在不同。他们的组成也因同一物种内的细胞状态而异(如孢子vs菌丝)。这种变异影响了不同物种中给定DNA提取程序的提取效率。细菌采用革兰氏染色法可以区分为2大类，革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌细胞壁厚，由肽聚糖网状分子形成一种透性障，因此细胞裂解步骤也尤为关键。细胞裂解可以通过化学处理(用洗涤剂，酸或碱性试剂)，酶降解细胞壁成分(用酶如蛋白酶K，裂解酶和几丁质酶)或使用机械/物理方法(如超声，珠打，高温等)来实现(Alessandra Frau et al.2019)，任一种单个方法的使用都可能会存在一定的漏检风险。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明拟解决的核心技术问题是临床感染样本病原微生物核酸释放不足而导致的二代感染宏基因组检测漏检现象，为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明首先提供一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本病原体的处理方法，包括如下步骤

1)样品预处理步骤：取感染样本离心处理，保留部分上清及沉淀；

2)样品溶菌破壁步骤：

预处理后样本加入终浓度大于1mg/mL的溶菌酶温育；

温育后样本加入Lysing Matri E管，加GB裂解液裂解；MP破壁仪震荡破碎，低温离心。