[发明专利]一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于酶工程领域，公开了一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用，脂肪酶嵌合体氨基酸序列如SEQ NO.1所示，编码脂肪酶嵌合体的基因核苷酸序列如SEQ NO.2所示。构建方法如下：(1)pcr扩增出GMGL的N端前160个氨基酸肽段；(2)无缝克隆方式将步骤(1)的氨基酸肽段替换到CoMGL对应肽段得到重组质粒；(3)将测序成功的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞内进行异源表达与纯化，得到脂肪酶嵌合体160。改造后的嵌合体160在最适条件的比酶活为741.8U/mg，是野生型CoMGL的4.9倍，是野生型GMGL的2.7倍；最适反应温度为70℃，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用。

背景技术

甘油单酯在工业中具有重要意义，在化妆品行业，由于其良好的乳化效果，甘油单酯常作为乳化剂添加到护肤乳霜和发乳中；在医药领域，含有多不饱和脂肪酸的单甘酯(EPA,DHA)对于心血管疾病具有预防作用；月桂酸单甘酯具有防腐作用，在食品行业中常被用来作为防腐剂延长食品保质期。脂肪酶是在1856年由Claude Bernard首次发现的，它使用类似于酯酶的亲核机制来催化不同底物的水解和合成反应。(Woolley P V,Petersen SB,Industrifond N.Lipases:their structure,biochemistry and application[J].1994.)脂肪酶催化反应具有催化效率高、反应条件温和和副产物少的优点，因此在工业应用中有巨大的价值。甘油单酯脂肪酶(MGL)是一种具有特异底物选择性的脂肪酶，其只能够水解甘油单酯，生成甘油和对应的脂肪酸，而不能催化甘油二酯和甘油三酯的水解。在催化甘油和脂肪酸的合成反应中也只能生成甘油单酯而不能生成甘油二酯和甘油三酯。

在工业生产中，有很多反应需要在高温或者中高温下进行且需要反应较长时间，而很多耐热性较差的脂肪酶在遇到高温时则会迅速变性失活，这大大限制了他们在工业中的应用，因此许多野生型的脂肪酶并不能直接使用于工业应用，而需要先进行一定的分子改造。

现有的针对酶的热稳定性的改造技术不能同时起到提高比酶活的效果，例如，Mitsutaka等人采用易错PCR技术对来源于Rhizopus niveus的脂肪酶进行突变来提高酶的最适反应温度，最终筛选出了一个含有三个突变位点(P18H、A36T和E218V)的最佳突变体，最适温度提高了15℃，但纯化后突变型脂肪酶的比酶活是野生型的80％。(Kohno M,EnatsuM,Funatsu J,et al.Improvement of the optimum temperature of lipase activityfor Rhizopus niveus by random mutagenesis and its structural interpretation[J].Journal of Biotechnology,2001,87(3):203-210.)。Jeong等人通过使用二硫键设计程序(Disulfide by design TM)对Bacillus stearthermophilus No.236进行了二硫键的设计，来识别具有二硫键形成几何特征的残基对，并最终筛选出一对(Ser100和Asn150)，将这两个氨基酸分别替换成半胱氨酸，结果表明突变体的T_50(20min)比野生型提高了5℃，但催化活力没有变化。(Jeong M Y,Kim S,Yun C W,et al.Engineering a de novo internaldisulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from Bacillusstearothermophilus No.236[J].Journal of Biotechnology,2007,127(2):300-309.)

因此，需开发一种耐高温、高酶活的甘油单酯脂肪酶，来解决目前甘油单酯脂肪酶催化效率和温度耐受性不足以达到工业要求的问题。

发明内容