[发明专利]一种基于环境DNA宏条形码技术的底栖动物完整性评价方法

权利要求书

1.一种基于eDNA宏条形码技术的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)参考点和受损点的确定；

(2)采集参考点和受损点样品并提取环境DNA；

(3)以提取的环境DNA为模板，扩增条形码片段、测序并基于样本对应的操作分类单元信息进行物种注释；

(4)根据步骤(3)结果计算定义的多种生物完整性指数候选指标；

(5)根据步骤(4)的计算结果筛选最终的生物完整性指数指标；

(6)根据步骤(5)中确定的最终指标计算底栖动物生物完整性得分；

(7)根据底栖动物生物完整性得分划分底栖动物健康等级。

2.根据权利要求2所述的一种基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：步骤(1)中所述参考点的确定条件为：

a)湖库参考点：(i)总氮、总磷等营养盐指标达到地表水Ⅳ类水标准；(ii)综合营养状态指数小于监测样本的25％分位数；(iii)有沉水植被分布；(iv)样点水域无航道、养殖和娱乐等功能，受水利工程影响小；

和/或b)河流参考点：(i)总磷≤0.3mg/L，氨氮≤2.0mg/L；(ii)监测断面上游来水方向有湖、荡等前置缓冲区或沿岸有水生植物分布。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(2)样品采集包括：采集水体底部沉积物，冷冻保存；环境DNA提取包括解冻，乙醇浸提，离心，DNA提取。

4.根据权利要求3所述的一种基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(3)中，扩增环境DNA的引物对包括上游引物mlCOIintF：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC和下游引物为dgHCO2198：TAAACYTCAGGRTGACCRAARAAYCA；所述测序包括对扩增产物进行高通量测序；所述物种注释包括通过qiime、usearch等软件平台分析获得每个样本对应的操作分类单元信息，并采用NCBI数据库对OTU进行物种注释。

5.根据权利要求4所述的一种基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(4)中定义的生物完整性指数候选指标需要包括评价群落丰富度、物种优势度、物种组成、物种耐污值、遗传多样性的指标。

6.根据权利要求5所述的一种基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：所述定义的生物完整性指数候选指标不少于27种。

7.根据权利要求3-6任一所述的基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：所述定义的生物完整性指数候选指标及计算公式包括如下：

8.根据权利要求7所述的一种基于eDNA宏条形码监测的底栖动物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(5)中筛选最终的生物完整性指数指标包括：

a)分布范围筛选：计算每个指数分布的最小值，Q25，中位数，Q75，最大值及值0的点位占比，保留在80％以上点位的值0且最大值Q75中位数Q25最小值的指数，舍弃值域区间相对狭窄的指标；

b)箱体判别分析：采用箱线图法分析进入判别能力分析的各参数在参照状态和受损状态之间的分布情况，比较参照状态和受损状态25th～75th分位数范围，保留箱线图箱体重叠情况≥2的指标；

c)相关性分析：对步骤b)中保留的指标进行Pearson相关分析，检验各指标反映信息的独立性；选常用且代表性强的指标作为优先保留指数，剔除掉和优先保留指数高度相关的指标，所述高度相关是指两个指标间的相关系数|r|大于0.750；所述优先保留指数包括M01_总分类单元数，M12_颤蚓科_仙女虫科占比，M27_平均遗传多样性，M02_软体动物分类单元或M18_软体动物占比；M24_BMWP指数或M25_ASPT指数或M26_BI指数；

d)确定最终指标：根据上述步骤a)、b)、c)确定最终候选指标。