[发明专利]一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统及其构建方法

说明书

本发明公开了一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统及其构建方法，属于基因检测分析领域，系统包括：微生物序列参考库模块、结核分枝杆菌耐药参考库模块、病原微生物鉴定模块、突变检测模块和耐药数据库注释模块；基于该系统的构建方法包括：构建数据比对的微生物序列参考库，将测序数据比对到微生物序列参考库并鉴定病原微生物，构建用于突变注释的结核分枝杆菌耐药参考库，将来源于结核分枝杆菌的序列比对到结核分枝杆菌参考基因组并鉴定基因突变，将结核分枝杆菌的基因突变位点与结核分枝杆菌耐药参考库关联分析突变位点的耐药性质；本系统能够快速鉴定病原微生物和检测结核分枝杆菌耐药性质，且灵敏度和特异性高。

技术领域

本发明涉及基因检测分析领域，特别是一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统及其构建方法。

背景技术

Nanopore测序是一种单分子、实时测序的新一代测序方法，其以单分子DNA（RNA）通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。Nanopore测序具有长度长、实时测序、按需测序以及灵活、可扩展等特点。与传统测序技术不同的是，用户可以自行掌握测序时间、地点、以及需要使用的芯片数量，这意味着用户可以根据样本的数量选择芯片数量，随数据量要求随时启动和停止实验。

结核分枝杆菌是结核病的病原体，随着抗结核药物的不断发展和居民卫生状况的改善，结核病的发病率和病死率曾大幅度下降。但自20世纪80年代以来，由于结核分枝杆菌耐药菌株，尤其是耐多药菌株的产生和传播，肺结核的发病率又有所提升，是导致人类死亡的重要疾病之一。我国“十三五”结核病防治规划的目标是在2030年，要使肺结核发病率和病死率降低，必须实行结核病的早期诊断及其耐药性检测。采用传统的结核分枝杆菌分离培养和药敏试验通常需要1-2月时间，显然不能满足临床开展有效治疗的需要。因此，阐明结核分枝杆菌耐药机制，建立快速检测耐药结核分枝杆菌的诊断试验，已成为当前结核病研究的重要课题。

现有的结核分枝杆菌耐药检测方法耗时长，且灵敏度和特异性低，本发明解决这样的问题，具有广泛应用于临床的潜力。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统及其构建方法，本发明能够快速、准确鉴定病原微生物和检测结核分枝杆菌耐药性质。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统，包括：微生物序列参考库模块，菌株耐药参考库模块，病原微生物鉴定模块，突变检测模块和耐药数据库注释模块；

微生物序列参考库模块为通过多个数据库的微生物rRNA序列构建微生物序列参考库，对序列进行过滤，形成高可信度的微生物序列参考库；

病原微生物鉴定模块包括：测序数据样品拆分模块，数据质控处理模块，比对分析模块和物种分类模块。

测序数据样品拆分模块为：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，每个样品都具有独特的barcode序列，每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，将比对分数大于80的序列视为可信的分配；

数据质控处理模块为：采用NanoFilt软件进行质控，每条序列都有一个平均测序数据质量值Q，若Q值小于7的序列为不合格序列，将被删除；

比对分析模块为：将质控处理后的序列采用minimap2进行快速比对，计算reads的identity和coverage，筛选identity 大于90%且coverage大于85%的结果；

物种分类模块为：将序列与微生物序列参考库进行比对，选择比对分数最高、identity大于90%且coverage大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录；将最佳比对记录ID与物种谱系数据库进行匹配，获取物种分类结果；