[发明专利]一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统及其构建方法

权利要求书

1.一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统，其特征在于，包括：微生物序列参考库模块，菌株耐药参考库模块，病原微生物鉴定模块，突变检测模块和耐药数据库注释模块；

所述微生物序列参考库模块为通过多个数据库的微生物rRNA序列构建微生物序列参考库，对序列进行过滤，形成高可信度的微生物序列参考库；

所述病原微生物鉴定模块包括：测序数据样品拆分模块，数据质控处理模块，比对分析模块和物种分类模块；

所述测序数据样品拆分模块为：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，每个样品都具有独特的barcode序列，每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，将比对分数大于80的序列视为可信的分配；

所述数据质控处理模块为：采用NanoFilt软件进行质控，每条序列都有一个平均测序数据质量值Q，若Q值小于7的序列为不合格序列，将被删除；

所述比对分析模块为：将质控处理后的序列采用minimap2进行快速比对，计算reads的identity和coverage，筛选identity 大于90%且coverage大于85%的结果；

所述物种分类模块为：将序列与微生物序列参考库进行比对，选择比对分数最高、identity大于90%且coverage大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录；将最佳比对记录ID与物种谱系数据库进行匹配，获取物种分类结果；

所述突变检测模块为对来源于菌株的reads采用minimap2比对到菌株参考基因组，采用varscan2检测基因突变位点，获得bam文件，利用samtools对bam文件进行排序，使用samtools mpileup提取mpileup文件，再使用varscan2对mpileup文件进行处理，获得突变结果并以vcf格式保存，然后使用Snpeff对突变结果进行基因注释；

所述菌株耐药参考库模块为以CARD数据库结合文献报道的菌株耐药位点信息整合成自建菌株耐药参考库；

所述耐药数据库注释模块为对基因突变位点进行注释，获取该突变位点对应的耐药药物名称。

2. 根据权利要求1所述的一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统，其特征在于，所述微生物序列参考库模块中的多个数据库包括：NCBI 16S rRNA、18SrRNA、ITS 、SILVA和UNITE数据库。

3.根据权利要求1所述的一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统，其特征在于，所述微生物序列参考库模块中对序列进行过滤的具体方法包括：

步骤a：将来源不同的序列合并成一个综合数据库，并剔除重复序列；

步骤b：筛选有文献支持的序列作为高可信度参考序列。

4. 根据权利要求1所述的一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统，其特征在于，计算reads 的identity和coverage的方法为： minimap2比对结果中第13列含有前缀de:f:，该第13列值加上identity等于1；minimap2比对结果第2列代表序列长度，第3列代表比对起始位置，第4列代表比对终止位置，将第4列与第3列的差值除以第2列等于coverage。

5. 根据权利要求1所述的一种基于Nanopore测序仪进行结核分枝杆菌耐药检测分析系统，其特征在于，所述菌株参考基因组为结核分枝杆菌参考基因组；所述结核分枝杆菌参考基因组为Mycobacterium tuberculosis H37Rv，NCBI登录号为NC_000962.3。