[发明专利]基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用，本发明筛选得到一条活性较高的crRNA和一对具有高灵敏性和高特异性的扩增引物，利用CRISPR‑Cas12a检测系统结合一种双标记荧光探针(ROX)，在加热型保温杯中即可完成扩增反应。最终能够实现检测结果直接裸眼可视或荧光可视，针对日本乙型脑炎病毒核酸的检测灵敏度为9拷贝/微升，且能特异区分出猪易感的其他病毒，例如ASFV、PRRSV、PDCoV、TGEV等。本发明操作便捷且设备简易，具有成本低、省时高效、高特异性和高灵敏性等优点，可广泛应用于各大生猪养殖企业，提高养殖业经济效益、为早期诊断提供便利。

【技术领域】

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用。

【背景技术】

流行性乙型脑炎是人畜共患的自然疫源性疾病，以三带喙库蚊等吸血昆虫为主要媒介，是我国夏秋季流行的主要传染病之一。该病是以中枢神经系统病变为主的急性传染病，临床上急起发病，有高热、意识障碍、惊厥、强直性痉挛和脑膜刺激征等症状，重型患者愈后往往有后遗症，对儿童危害极大。乙脑最早于19世纪70年代在日本发现，此后每10年有一次大流行。2008年乙脑疫苗被纳入计划免疫项目内，发病率得到相对控制，但是由于部分地区免疫接种执行力度不足，尤其是卫生防疫条件相对差的乡镇，造成乙脑疫苗接种率不高。加之全球气候变暖，生态环境改变，蚊媒繁多，增加了疫情的控制难度。

目前，我国用于乙脑的实验室检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学检测和分子生物学技术等。(1)病毒的分离与鉴定法是检验乙脑的经典方法，可以准确获得病毒的主要信息，如其基因型、是否变异等。但由于病毒载量低、分离困难、工作量大、试验条件要求高、检测时间长而且影响因素多等，不利于乙脑的快速检测。(2)血清学检测方法有很多，例如补体结合试验(CFT)、中和试验(NT)、血凝制试验(HI)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等，它们多以检测乙脑患者血清及脑脊液中特异性抗原和抗体为主。补体结合试验、中和试验、血凝抑制试验是流行病学调查常用的传统方法，但是这三种方法需要采集急性期和恢复期双份血清进行检测，诊断费时费力，不能达到早期快速诊断的目的。ELISA方法可对特异性乙脑抗体 IgM和IgG进行检测，但是此方法操作复杂，耗时长且灵敏度不高，因此也无法作为最佳的快速诊断方法。(3)分子生物学检测方法主要采用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，目前认为RT-PCR是病原学诊断方法中有效的早期诊断方法。近年发展起来的实时荧光PCR，通过在反应体系中加入SYBR Green I荧光染料或一条特异性TaqMan荧光探针，能够实现闭管检测。既保持了传统PCR技术的灵敏性等特点，又避免了假阳性污染，缩短了检测时间。但是PCR方法需要昂贵的仪器和严格的实验室条件，仅设备优良的大型综合医院及科研机构才会配备，限制了其应用，使其在疾病防控及社区检测中无法充分发挥作用。

核酸的快速检测在疾病早期诊断与生物技术应用等方面都占据了举足轻重的位置，被广泛应用于医疗卫生行业、进出口检疫与食品加工等领域。

随着科学技术日新月异的发展，CRISPR检测技术逐渐代替了原来的需通过扩增核酸的检测技术，具有特异性强、灵敏度高、节约时间和节省成本的显著优点。例如使用率最高的PCR 或RT-PCR，与CRISPR检测技术相比，它们对于实验器材和实验人员的要求较高，很难实现基层化、普遍化应用，即即时检测(POCT)。

【发明内容】

现有技术中属PCR或RT-PCR应用最广泛，但它们对实验器材和实验人员的要求较高、很难实现基层化、普遍化应用，即很难应用于即时检测(POCT)，本发明提供了基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用，利用RT-LAMP技术结合CRISPR-Cas12a 检测，使用核酸直接裸眼或荧光可视化检测的双标记荧光探针，开发了一种能裸眼、快速、灵敏、高特异、检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测方法与试剂盒。本发明开发的日本乙型脑炎病毒核酸的裸眼检测试剂盒具有极大的应用价值。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：