[发明专利]基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的引物组，其特征在于：所述引物组包括针对C基因的RT-LAMP引物组：

C-1引物对：上游序列：5’-ggagccatgaagttgtcaa-3’；

下游序列：5’-atcctctggatcattgcc-3’；

C-2引物对：上游序列：5’-ggtgggaatcacgataacgtctgccaggggaagcttttgatg-3’；

下游序列：5’-caatcgacgtcggctacatgtggtaagcttaggacattcg-3’；

C-3引物对：上游序列：5’-caatgtccgtgttgttaatg-3’；

下游序列：5’-gtgaggacactatcacgtac-3’。

2.基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述引物组；

所述试剂盒的的扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0为1μL、10×IsothermaLAmpLification Buffer II为2.5μL、6mM的MgSO₄、1.4mM的dNTP Mix、C基因引物组混合液2.5μL、模板1μL、以无核酸酶的水补足至25μL；所述的C基因引物组混合液2.5μL，为10X引物，其中C-1引物组1μL、C-2引物组8μL、C-3引物组2μL。

3.根据权利要求2所述的基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述扩增反应于加热型保温杯中进行，保温杯温度范围为25-100℃。

4.一种检测日本乙型脑炎病毒的方法，其特征在于：采用权利要求1所述一种基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的引物组和权利要求2所述基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒，包括如下步骤：

1)日本乙型脑炎病毒核酸模板制备；

2)采用上述试剂盒的扩增体系和上述的引物组在65℃40min，80℃10min的反应条件下在加热型保温杯中扩增得到扩增产物；提取扩增产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定，当琼脂糖电泳检测出C基因模板有条带、非模板对照无条带时为阳性；当检测C基因模板和非模板对照均无条带时为阴性。

5.一种日本乙型脑炎病毒的裸眼可视化检测方法，其特征在于：采用权利要求1所述一种基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的引物组和权利要求2所述基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒，包括如下步骤：

1)日本乙型脑炎病毒核酸模板制备；

2)采用上述试剂盒的扩增体系和上述的引物组在65℃40min，80℃10min的反应条件下在加热型保温杯中扩增得到扩增产物；

3)将步骤2)获得的扩增产物进行Cas12a酶切反应；反应体系为：1μM的纯化的C基因的crRNA、3μL的步骤2)的LAMP扩增产物、0.5μM的Cas12a、20μM的ssDNA-reporter(ROX-N12-BHQ2)、2μL的10x NEB buffer 2.1、以无核酸酶的水补足至20μL；

4)当在无激发光、蓝光和紫外光下同时检测出C基因的荧光信号时，证明样本为阳性；反之则为阴性；

5)将步骤2)获得的扩增产物进行试纸条Cas12a酶切反应；反应体系为：1μM的纯化的C基因的crRNA、3μL的步骤2)的LAMP扩增产物、0.5μM的Cas12a、2.5μM的ssDNA-reporter(FAM-N12-Biotin)、2μL的10x NEB buffer 2.1、以无核酸酶的水补足至20μL；在37℃30min，98℃2min反应后，将反应完产物转移到1.5mL离心管中，加入80μL的MileniaGenline Dipstick Assay Buffer，吹打混匀室温反应5min，放入试纸条鉴定检测结果；当试纸条的控制线与检测线同时出现红色条带即为阳性；当试纸条的控制线出现红色条带，检测线未出现红色条带即为阴性；

所述C基因的crRNA核酸序列为：5’-cagacgttatcgtgattcccacctatctacaacagtagaaat-3’。

6.根据权利要求5所述的一种日本乙型脑炎病毒的裸眼可视化检测方法，其特征在于：所述扩增反应于加热型保温杯中进行，保温杯温度范围为25-100℃。