[发明专利]一种酿酒酵母大片段基因编辑的方法

说明书

本发明公开一种酿酒酵母大片段基因编辑的方法，步骤如下：⑴设计GIM基因表达盒：将半乳糖启动子控制的I‑SceI基因的表达盒从质粒pGSHU扩增下来，并在上、下游引物中各插入一个I‑SceI识别序列，同源臂为52bp；⑵构建双DSBs突变株：利用PEG/LiAC法向酵母中进行转化，涂布于Hyg筛选板上生长，挑取生长出的单克隆菌株提取基因组，验证；⑶设计目的基因表达盒：通过重叠延伸PCR，将目的基因与KanMX6筛选标记连接起来，上下游同源臂68bp，该同源臂为双DSBs中上游DSB两端的碱基序列。本发明使得大片段基因的敲入成为可能，实现敲入位点可控的同时，降低了脱靶现象发生的几率，提高准确性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，是一种在酿酒酵母中删除大片段DNA序列或者整合大段外源基因的方法。

背景技术

基因编辑是对特定微生物/细胞中的目标基因进行删除、敲入或替换，以获得新的功能或表型的一种生物技术，是基础研究以及现代食品、药物、生物化工等产业的根基，在工业微生物菌种改造以及疾病治疗等领域具有广泛的应用，因其特异性和高效性等特点，逐渐成为近年来科学研究的重点。

在DNA的特定部位，当产生DNA双链断裂(Double Strand Breaks，DSB)时，可与含有同源序列的DNA片段进行重组，从而导致基因序列的改变或外源DNA片段的整合。传统的基因编辑是借助细胞内自然发生或物化手段(紫外线、化学诱变剂)诱导的DSB，来实现对目标基因的敲入或删除。但自发/随机DSB在目标靶点产生DSB的概率很低，因此这类基因改造方法效率不高。近些年来，通过定点DSB诱导的基因重组技术发展迅猛，已成为基因编辑的主流。例如锌指核酸酶(ZFN)系统，类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)系统，以及当下应用广泛的CRISPR系统。这些体系的基本思路都是在特定靶标位点引入产生一个DNA双链断裂，通过提高宿主细胞的同源重组效率以及非同源末端连接效率得以实现基因删除及敲入的目的。

锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)是一类具有特异性识别DNA序列的人工核酸酶，由锌指DNA结构域与非特异性的Fok I DNA切割域这两部分组成。ZFNs技术需要针对靶位点两端的双链DNA序列各设计1个ZFN，2个ZFN的特异性DNA结合域会结合到靶位点，当2个识别位点间距为6-8bp时，2个Fok I DNA切割域结合形成二聚体，对靶位点两端的双链DNA进行酶切，形成DNA双链断裂,该技术是第一代普遍使用的基因编辑技术。

转录激活子样效应核酸酶(Transcription Activator-like EffectorNucleases，TALENs)技术是继ZFNs之后的另一种高效靶向基因编辑新技术。TALENs包含一个识别特异DNA序列的TALENs蛋白和非特异性的Fok I核酸酶，由两个TALENs蛋白识别和结合DNA靶点组成，同时Fok I核酸酶对靶DNA进行切割，造成DNA双链断裂从而实现对基因组靶位点的编辑。

ZFNs和TALENs技术可在多种动物及植物中成功实现基因的定点编辑，但这两种技术定向打靶依赖于特异性结合蛋白的合成，操作起来繁琐费时且打靶效率低；其次，实验周期长，成本高，且实验室需要有一定的基础才可以使用。

CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，包含CRISPR基因座和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分。当外来的噬菌体首次侵染细菌后，细菌基因组上会整合一小段噬菌体的序列，当噬菌体再次侵染细菌时，细菌会通过整合的这一小段序列对噬菌体进行快速地识别，会迅速对外来噬菌体的核酸进行切割，可以有效地对gRNA(Guide RNA)介导的特定位点DNA进行编辑。

CRISPR/Cas系统周期短，成本较低，但仍有一些缺点：CRISPR/Cas系统可能在非目的位点进行核酸切割，形成脱靶效应，从而增加未知重组的风险。除此之外，CRISPR/Cas系统质粒本身较大，转染难度也很大。