[发明专利]一种羊痘病毒属病毒通用Cycleave荧光PCR检测方法

说明书

本发明提供一种可同时检测羊痘病毒属牛结节性皮肤病、山羊痘与绵羊痘的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。本发明所提供的引物对和探针组，其正向引物的序列为SEQID NO：1；反向引物的序列为SEQ ID NO：2；探针的序列为SEQ ID NO：3，且探针的第8位为RNA碱基。本发明所提供的Cycleave荧光PCR检测羊痘病毒属病毒的引物、探针及方法具有检测灵敏度高、特异性好、高通量和操作简便的优点。

技术领域

本发明属羊痘病毒属病原微生物检测技术领域，具体涉及一种可同时检测羊痘病毒属牛结节性皮肤病、山羊痘与绵羊痘的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。

背景技术

牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)、山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)同为羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)成员，该三种病毒都是家养反刍动物中须防控的重要疫病，已在世界范围内对其流行地区的反刍动物生产和贸易造成巨大经济损失。

牛结节性皮肤病是一种传入性外来动物疫病，我国在2019年8月于新疆伊犁哈萨克自治州首次确诊该病。2020年6月来，牛结节性皮肤病在我国境内迅速蔓延，在福建、江西、广东、安徽、浙江等省相继报告检测到了该病。牛结节性皮肤病患牛表现为皮肤、粘膜上广泛性的结节样病变，可致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发感染导致死亡，其发病率5-45％，病死率最高可达10％，严重威胁我国养牛业持续健康发展。

山羊痘和绵羊痘并称羊痘，是所有动物痘病中危害最为严重的一种，数年来一直在我国部分地区持续流行，2020年山西、内蒙、宁夏等多地报道发生。该病临床症状为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生红斑、丘疹、疱疹、水泡等，发病率50％～80％，发病后成年羊死亡率达40％，羔羊死亡率可达100％，严重影响羊肉和羊毛质量。目前，在我国牛结节性皮肤病暂定为二类动物疫病，山羊痘和绵羊痘为一类动物疫病，三者均为世界动物卫生组织(OIE)法定报告疾病。

通过发热、皮肤或黏膜结节(或丘疹)、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断羊痘病毒属引起的疾病，但其确诊依赖实验室检测，特别是与症状相似的口蹄疫、羊口疮、蓝舌病等常见反刍动物疫病进行区分时，此外还存在无症状隐性感染情况。开发快速、准确、简便的检测方法是防控的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同时检测羊痘病毒属牛结节性皮肤病、山羊痘与绵羊痘的Cycleave荧光PCR引物对、探针，以及应用该引物对和探针的检测方法。

本发明首先提供一种检测羊痘病毒属病毒的引物对和探针，具体序列信息如下：

羊痘病毒属检测正向引物CaPV forward：

5′-TGGAAATRGATCCACCAGTTAAAG-3′(SEQ ID NO：1)

羊痘病毒属检测反向引物CaPV reverse：

5′-TCGMACTAGCGAACATGGAA-3′(SEQ ID NO：2)

羊痘病毒属检测探针CaPV probe：

其中，检测探针CaPV probe的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记，下滑线位置为标记的RNA碱基位点；简并碱基M＝A/C；R＝A/G。

上述引物和探针用于制备检测羊痘病毒属病毒的Cycleave荧光PCR检测体系。

本发明还提供一种检测羊痘病毒属病毒的Cycleave荧光PCR方法，包括如下的步骤：