[发明专利]同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法

说明书

本发明提供了同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法，该方法以蔗糖为底物，在蔗糖溶液中加入被测蔗糖酶或果聚糖酶酶解蔗糖形成含葡萄糖和果糖的第一酶解液，然后用硼氢化钠将第一酶解液所含葡萄糖和果糖转化成甘露醇和山梨醇，再向含甘露醇和山梨醇的蔗糖溶液中加入被测果聚糖酶或蔗糖酶酶解蔗糖得到含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的试样；将含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的试样用离子色谱‑脉冲安培法测定其所含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的含量，通过试样中甘露醇和山梨醇的含量计算蔗糖酶或果聚糖酶的活力，通过试样中葡萄糖和果糖的含量计算果聚糖酶或蔗糖酶的活力。

技术领域

本发明属于蔗糖酶活力和果聚糖酶活力测定技术领域，涉及同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法。

背景技术

蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26)又称转化酶，广泛应用于食品和发酵工业；果聚糖酶(Inulinase,EC3.2.1.80)又称菊粉酶，广泛用于生产高果糖浆、酒精，甚至可在生物柴油生产及医药产业、乳酸制备中应用。酶活力是反应酶催化化学反应的能力，酶活力的大小是酶应用的重要指标。因此，酶活力的测定至关重要。

关于蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的测定，现有技术是分别单独进行测定。蔗糖酶活力测定采用的方法主要为3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)，果聚糖酶活力测定采用的方法主要包括费林试剂热滴定法、3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)、塞氏比色法、Somogi-Nelson法。由于两种酶活力的测定是分别单独进行测定，必然会增加测试工作量及试剂的使用，且采用上述方法会涉及有毒有害试剂的使用(如苯酚、间苯二酚、硫酸)，损害实验人员身体健康，不利于环境保护。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法，采用此方法，不仅通过一次操作就能获得蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的测定结果，而且可避免有毒有害试剂的使用，有利于实验人员身体健康和环境保护。

本发明所述同时测定蔗糖酶活力和果聚糖酶活力的方法，以蔗糖为底物，在蔗糖溶液中加入被测蔗糖酶或果聚糖酶酶解蔗糖形成含葡萄糖和果糖的第一酶解液，然后用硼氢化钠将第一酶解液所含葡萄糖和果糖转化成甘露醇和山梨醇，再向含甘露醇和山梨醇的蔗糖溶液中加入被测果聚糖酶或蔗糖酶酶解蔗糖得到含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的试样；将含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的试样用离子色谱-脉冲安培法测定其所含甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖的含量，通过试样中甘露醇和山梨醇的含量计算蔗糖酶或果聚糖酶的活力，通过试样中葡萄糖和果糖的含量计算果聚糖酶或蔗糖酶的活力。

上述方法有以下两种操作：

1、第一种操作的步骤如下：

(1)试样的制备

①蔗糖酶、果聚糖酶和蔗糖溶液的配制

用pH 6.0的乙酸钠缓冲液分别溶解被测蔗糖酶、被测果聚糖酶、底物蔗糖，得到浓度为1～10U/mL的蔗糖酶溶液、浓度为1～10U/mL的果聚糖酶溶液及浓度为0.1～0.5mol/L的蔗糖溶液；

②蔗糖酶酶解蔗糖

将0.1～0.5mL步骤①配制的蔗糖溶液加入刻度为25～50mL的试管中，再将0.01～0.02mL步骤①配制的蔗糖酶溶液加入所述试管中，混合均匀后在37℃恒温水浴中保温10～20min酶解蔗糖，然后置于沸水浴中加热3～5min终止酶促反应后取出冷却至室温，形成含葡萄糖和果糖的第一酶解液；

③葡萄糖和果糖转化为相应醇

向步骤②形成的含葡萄糖和果糖的第一酶解液中加入1.0～2.0mL浓度为10～20mg/mL的硼氢化钠溶液并混合均匀，然后置于60±5℃的恒温水浴摇床中振摇30～40min后取出冷却至室温形成含甘露醇和山梨醇的蔗糖溶液，再加入1～3mL体积浓度为0.5～1.0％的乙酸溶液并混合均匀后用氢氧化钠溶液调pH值为6.0；