[发明专利]一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测氨甲喋呤代谢标志物ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)和SLCO1B1(c.1865+4846TC)基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1(C3435T)扩增引物、ABCB1(C3435T)测序引物、MTHFR(C677T)扩增引物、MTHFR(C677T)测序引物、SLCO1B1(c.1865+4846TC)扩增引物、SLCO1B1(c.1865+4846TC)测序引物和阳性对照。

2.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1(C3435T)扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。

3.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述MTHFR(C677T)测序引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。

4.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述SLCO1B1(c.1865+4846TC)扩增引物如序列表SEQ ID NO:5～6所示。

5.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1(C3435T)测序引物如序列表SEQ ID NO:7所示，MTHFR(C677T)测序引物如序列表SEQ IDNO:8所示，SLCO1B1(c.1865+4846TC)测序引物如序列表SEQ ID NO:9所示。

6.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述测序引物为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的DNA序列的结合物。

7.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、18mM醋酸镁、dNTPS、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、结合单链核酸的重组酶和海藻糖。

8.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照包括浓度为20ng/ul的ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)、SLCO1B1(c.1865+4846TC)杂合型基因组DNA。

9.一种采用根据权利要求1～8任一项所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用多重RPA扩增进行扩增；

b.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合；

c.变性液处理得到单链产物；

d.加入洗涤缓冲液漂洗；

e.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；

f.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ABCB1(C3435T)测序引物、MTHFR(C677T)测序引物、SLCO1B1(c.1865+4846TC)测序引物、ddGTP、ddCTP；

g.焦磷酸测序；

h.确定ABCB1(C3435T)位点、MTHFR(C677T)位点、SLCO1B1(c.1865+4846TC)位点甲氨喋呤药物剂量及不良反应位点的基因型。

10.一种根据权利要求1～8任一项所述的甲氨蝶呤代谢标志物的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于体外检测待测样本中的ABCB1(C3435T)、MTHFR(C677T)和SLCO1B1(c.1865+4846TC)基因多态性。