[发明专利]一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法

说明书

本发明公开了一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，包括以下检测步骤，样本前处理：取鼻/咽分泌物拭子至含样本保存液的保存管中，充分洗涤后将液体全部吸取至新的离心管中离心弃上清；核酸提取：向离心管中加入提取液、蛋白酶K，涡旋震荡后加热、离心，取上清液用于PCR反应；多重PCR加样及扩增：取多重呼吸道病毒PCR Mix、核酸提取液和无酶水进行多重PCR加样及扩增；膜芯片杂交：通过全自动膜芯片核酸分子杂交仪将多重PCR扩增产物与膜芯片进行杂交反应；出具检测结果报告：通过全自动膜芯片核酸分子杂交仪自动分析系统，直接出具检测结果报告。本发明结合多重PCR和反向斑点杂交技术，可实现单次反应同时检测单个样本中多种呼吸道病原体并自动出具检测结果报告。

技术领域

本发明涉及一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，属于病毒检测技术领域。

背景技术

呼吸道感染是临床常见的疾病之一，主要病原体包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中超过90％是由呼吸道病毒感染引起，急性呼吸道感染是儿童最主要的威胁之一，多发于儿童、老年人及免疫功能低下者，常见的有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、鼻病毒、副流感病毒等，多数具有很强的感染力而且传播快、潜伏期短、发病急、临床表现相似，患者均表现为发热和上呼吸道感染症状，单从临床表现很难区分感染病原体。

目前常用的检测方法如下：病毒常规培养、血清学检验、抗原抗体检测及分子生物学方法(荧光聚合酶链式反应法及基因芯片法)；大多数病毒的检测采用病毒培养和血清学检测，前者通常被认为是诊断的“金标准”，但因细胞分离对培养技术的要求高，耗时长，不利于早期诊断。

血清学检测法虽方便易行，其检测双份血清需要间隔较长时间，检测结果不能及时应用于临床且血清学检测结果易受机体免疫水平的影响。

抗体抗原检测方法有免疫荧光法、酶联免疫吸附测定法等，此类方法检测速度快，但其敏感度较低，且病毒传播与抗体出现时间间隔较长，不利于微量感染会感染的早期诊断。

随着分子生物学技术的发展，呼吸道病原体核酸检测技术得到了蓬勃的发展，目前临床主要采用荧光定量聚合酶链式反应技术对疑似呼吸道病原体感染的患者进行筛查和确认，但该方法人工操作耗时长，难以在单次反应中检测多种病原体，部分号称能够同时检测多种病原体的产品或方法不外乎以下两种实现形式：第一，受限于荧光通道的数量，单体系扩增/检测不超过4个指标，若超过4个荧光通道则会出现荧光通路的相互干扰，出现假阴性或假阳性的结果，若需4个指标以上，需分成2个及以上的体系进行检测，相较于单体系检测，试剂价格成倍增加，工作量也大大增加，第二，单体系检测一个指标，分96或384孔板中进行检测，可同时检测30-100多个靶标(算上质控及单样本的3个重复)，但该方法同样存在上述问题，试剂成本多倍增加，工作量极大。

除荧光定量聚合酶链式反应法外，基因芯片法也是现常用的分子生物学检测方法，其完美解决了荧光定量聚合酶链式反应技术检测通量低的问题，且通量可达成百甚至上千个靶标，但由于其设备、耗材等价格昂贵，目前在科研上使用较多，市场化程度较低。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，解决了呼吸道病毒检测速度慢、耗时长、敏感度低、成本高以及难以在单次反应中检测多种病原体的问题。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，包括以下检测步骤：

(1)样本前处理；

(2)核酸提取；

(3)多重PCR加样及扩增；

(4)膜芯片杂交；

(5)出具检测结果报告。