[发明专利]多重目标核酸的检测方法、试剂盒以及用途

说明书

本发明提供了一种多重目标核酸的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)根据多重目标核酸制备环介导等温扩增反应所需的混合物；其中所述混合物包括分别针对多重目标核酸设计的引物和探针组，所述引物和探针组中的每组包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP以及环引物和蝎状引物探针；待检测的核酸；(2)将步骤(1)所述的混合物置于恒定温度下进行扩增反应；(3)检测步骤(2)的反应结果。本发明提供的方法对待检测的目标核酸没有依赖性，针对每种目标核酸，选择合适的扩增区域，进行配套的引物设计即可开展目标核酸的检测分析。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种多重目标核酸的检测方法。

背景技术

近几年来，一系列基因检测方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进，由于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的发展，大大促进了基因检测研究的发展和应用。环介导等温扩增技术是由Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forward inner primer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5’-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5’-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物为F3和B3。另外的两条环引物(Loopprimes，LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。环介导等温扩增反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA聚合酶、dNTP等共同置于一定温度下(60-65℃)、经一个步骤即可完成。反应扩增效率极高，可在15-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，加之其有较高的灵敏度与专一性，非常适合应用于各种核酸检测。

LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是直接在产物中加入SYBR Green I染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。然而，这些方法都只能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对特定靶序列的特异性扩增，导致LAMP在检测目的序列时，其结果的判定缺乏特异性。因此，传统LAMP检测很难实现对多重目的片段的同时检测，这极大限制了LAMP的广泛应用。

鉴于上述问题，一些研究致力于发展多重LAMP检测技术。实现多重LAMP检测最常见的方法是在靶序列中寻找限制性内切酶酶切位点，将LAMP产物运用限制性内切酶消化，通过电泳消化后的LAMP产物，根据不同的电泳条带大小与相应的靶序列对应。然而，该方法需要两步完成，限制性内切酶酶切片段大小各异的LAMP产物时，耗时较长且酶切不完全，导致一条靶序列常常对应了几条电泳条带，使得多重LAMP的结果难判断。另一种实现多重LAMP检测的新技术是将LAMP扩增反应和焦磷酸测序结合。然而，该方法与限制性内切酶介导的多重LAMP检测技术一样，都需要两步完成，首先是LAMP扩增，然后通过焦磷酸测序对应到相应的靶序列。该方法操作繁琐，需要特定的试剂盒对LAMP产物进行纯化，测序过程需要特殊人员，以及普通实验室无法负担的测序仪和测序试剂。这些劣势限制了该方法的推广使用。

此外，现存的多重LAMP检测技术都无法实现快速检测，完成多重LAMP检测耗时大于2.5小时。由于LAMP反应的灵敏度极高，实行LAMP产物的开盖操作对以后的LAMP实验存在极大的污染。

综上，现有技术中的LAMP不论在单一扩增还是多重扩增的检测上都存在着难以克服的技术问题基于此，当前对能同时检测多重目标核酸的环介导等温扩增方法存在需求。

发明内容