[发明专利]一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε-聚赖氨酸生物合成方法

权利要求书

1.一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε-聚赖氨酸生物合成方法，其特征在于：

采用有机溶剂对柠檬酸发酵废水、废渣进行提取，并将其添加到ε-聚赖氨酸发酵过程中，进而促进ε-聚赖氨酸的合成，包括如下步骤：

步骤1：柠檬酸发酵种子培养

将黑曲霉孢子接种于PDA固体培养基中，在37℃培养箱培养5天直至长出黑色孢子，用接种环接种2环孢子进入柠檬酸发酵种子培养基中，于37℃、160rpm摇床中培养20-22h；

步骤2：柠檬酸发酵

将步骤1获得的成熟种子以15%接种量接入装有3L柠檬酸发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，发酵72h；

步骤3：柠檬酸发酵废水、废渣提取物的制备

步骤2获得的发酵液采用4层纱布过滤，获得滤液及滤渣；滤液及滤渣分别采用以下方法进行处理，获得柠檬酸发酵废水提取物以及废渣提取物：

3a、滤液采用常规钙盐法进行柠檬酸提取，即添加过量轻质碳酸钙于滤液中，充分搅拌直至体系pH至 6.5-6.8，离心后向上清液中加入正丁醇，充分搅拌，离心分层后，取正丁醇相，剩余萃余液再加入正丁醇，重复如上步骤萃取2次；萃取液合并后旋转蒸发，获得纯溶剂并浓缩提取物；浓缩液与乙醇溶液混合，静置2h后离心，上清液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水对提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废水提取物；

3b、滤渣水洗后加入乙醇，浸泡3h后于研钵中研磨，浸泡8-12h，离心，上清液旋蒸回收溶剂并获得浓缩液，浓缩液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水对提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后置于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废渣提取物；

步骤4：ε-聚赖氨酸发酵种子培养

将小白链霉菌接种于贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量80mL的500mL M3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε-聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌种子液；

步骤5：ε-聚赖氨酸发酵

在ε-聚赖氨酸的发酵过程中，添加柠檬酸发酵废水提取物或者柠檬酸发酵废渣提取物，以促进ε-聚赖氨酸的合成；

所述贝塔纳培养基配方为：葡萄糖10 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨2 g/L，琼脂20 g/L，pH7.5；

所述M3G培养基配方为：葡萄糖50 g/L，酵母粉5 g/L，(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，MgSO₄·7H₂O0.5 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.8 g/L，KH₂PO₄ 1.36 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03 g/L，ZnSO₄·7H₂O0.04 g/L，pH 6.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于添加柠檬酸发酵废水提取物的发酵过程包括如下步骤：

将M3G培养基配好加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115-121℃灭菌20-30min，结束冷却至室温后将以115-121℃单独灭菌20-30min的葡萄糖加入发酵罐；以8%的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30%以上的培养条件下发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽，在发酵过程中添加柠檬酸发酵废水提取物；在碳源耗完后立即补充预灭菌的60%葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5-15g/L之间，并以预灭菌的600 g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5-1g/L之间。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

柠檬酸发酵废水提取物于发酵24h时，以终浓度为500mL废水/L培养基量添加进发酵罐。