[发明专利]一种蓝藻藻胆体冷冻电镜制样的方法

说明书

本发明公开了一种蓝藻藻胆体冷冻电镜制样的方法，通过对体外纯化的蓝藻藻胆体蛋白进行交联，以及“正面上样，反面稀释”的上样方式克服了藻胆体常规冷冻制样的解聚、衬度差和优势取向的三大难点，应用本发明方法可以解析出了蓝藻藻胆体近原子级的高分辨率结构信息，为今后利用冷冻电镜解析各类蓝藻藻胆体的高分率结构提供了一种有效的方法。

技术领域

本发明涉及生物样品的冷冻电镜样品制备领域，具体涉及一种蓝藻藻胆体冷冻电镜制样的方法。

背景技术

蓝藻藻胆体是一类大型捕光天线蛋白复合体，其位于蓝藻细胞的内囊体膜外朝向基质的一侧，可以吸收光能并将能量传递至光系统反应中心。目前有很多针对藻胆体的生化实验研究其组装和能量转递机制，但是仍有很多疑问尚不清楚，所以迫切需要解析藻胆体的高分辨结构信息，结合这些生化结果来理解其的组装和能量传递机制。

蓝细菌的藻胆体在上世纪70年代就已经体外纯化出来，但是至今为止经过半个多世纪蓝藻藻胆体的近原子级高分辨率结构仍然没有得到解析。这是由于体外纯化的藻胆体只有在高磷酸盐(0.6～1.0mol/L)且常温(16～28℃)的环境下才能稳定存在，而在该环境下晶体不生长，所以不能用常用的X射线晶体衍射(X-ray)结构解析，而蓝藻藻胆体的分子量约为6000kDa左右，所以也不能利用核磁共振解析其结构，最终就剩下利用冷冻电镜技术解析其结构。

但是，目前为止利用冷冻电镜(Cryo-EM)解析蓝藻藻胆体结构有三个难点：1、蓝藻藻胆体样品只在常温环境下稳定存在，而冷冻电镜制样需要将样品速冻在-150℃左右的液态乙烷中，所以蓝藻藻胆体样品经过冷冻电镜制样常常会解聚；2、蓝藻藻胆体样品只有在高磷酸盐(0.6～1.0mol/L)环境下才能稳定存在，虽然Cryo-EM能在维持复合物稳定的高浓度磷酸盐下成像，但该环境下的样品在冷冻电镜下的衬度急剧下降，导致解析出蛋白复合体结构的分辨率不高；3、由于蓝藻藻胆体常为圆盘形，且底部与类囊体膜连接的部分有疏水结构域，所以蓝藻藻胆体的常规冷冻制样还存在优势取向，这会极大影响其三维重构模型的正确搭建。

发明内容

本发明的目的是提供一种蓝藻藻胆体冷冻电镜的制样方法，以克服藻胆体常规冷冻制样的解聚、衬度差和优势取向的三大难点，为利用冷冻电镜解析各类蓝藻藻胆体的高分率结构提供一种有效的方法。

为实现上述目的，本发明对蓝藻藻胆体通过1,5-戊二醛(GA)交联解决藻胆体低温解聚的问题，然后利用“正面上样，反面快速稀释”的方法快速降低样品中的磷酸浓度解决衬度问题，并在稀释缓冲液中加入去垢剂如NP40解决样品的优势取向问题，最终使得蓝藻藻胆体的冷冻制样能获得高完整性、好衬度、无优势取向的样品，为后续进行单颗粒样品数据采集及分析从而解析其高分辨率结构提供一种有效手段。具体的，本发明的技术方案如下：

一种蓝藻藻胆体冷冻电镜制样的方法，包括以下步骤：

(1)通过蔗糖梯度离心体外纯化蓝藻藻胆体；

(2)将体外纯化的蓝藻藻胆体溶液中的蔗糖除去，然后浓缩得到浓度为9～12mg/mL的藻胆体蛋白溶液，加入终浓度为0.005～0.015％(w/v)的1,5-戊二醛(GA)交联1～2分钟，然后加入pH 7.0Tris-HCl缓冲液终止反应；

(3)采用“正面上样，反面稀释”的方法进行冷冻电镜制样，包括：

(3-1)对冷冻制样用载网双面进行亲水化处理；

(3-2)将交联后的藻胆体蛋白样品上样到亲水化处理后的载网的正面；

(3-3)在载网反面快速加入与上样蛋白样品等体积的含非离子去垢剂的pH7.0Tris-HCl缓冲液，并吹吸2～3次；

(3-4)重复步骤(3-3)，使上样蛋白样品的盐浓度快速降低至原来的1/3。

上述步骤(1)对蓝藻藻胆体进行体外纯化的方法是现有技术公知的方法。