[发明专利]一种蓝藻藻胆体冷冻电镜制样的方法

权利要求书

1.一种蓝藻藻胆体冷冻电镜制样的方法，包括以下步骤：

1)通过蔗糖梯度离心体外纯化蓝藻藻胆体；

2)将体外纯化的蓝藻藻胆体溶液中的蔗糖除去，然后浓缩得到浓度为9～12mg/mL的藻胆体蛋白溶液，加入终浓度为0.005～0.015％(w/v)的1,5-戊二醛交联1～2分钟，然后加入pH 7.0 Tris-HCl缓冲液终止反应；

3)采用“正面上样，反面稀释”的方法进行冷冻电镜制样，包括：

3-1)对冷冻制样用载网双面进行亲水化处理，其中所述载网为金网；

3-2)将交联后的藻胆体蛋白样品上样到亲水化处理后的载网的正面；

3-3)在载网反面快速加入与上样蛋白样品等体积的含非离子去垢剂的pH7.0 Tris-HCl缓冲液，并吹吸2～3次；

3-4)重复步骤3-3)，使上样蛋白样品的盐浓度快速降低至原来的1/3。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中采用无糖的缓冲液对体外纯化的蓝藻藻胆体进行洗涤，除去蔗糖，然后浓缩为藻胆体蛋白浓度为9～12mg/mL的溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)采用的无糖的缓冲液为磷酸钠和/或磷酸钾缓冲液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所加入的pH 7.0 Tris-HCl缓冲液的终浓度为10～50μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)在18℃、湿度100％的条件下进行上样操作。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-1)通过辉光放电的方法对金网双面进行亲水化处理。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-2)中交联后藻胆体蛋白样品的上样体积为3～4μL。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-3)中所述非离子去垢剂为NP40或十二烷基-beta-D-麦芽糖苷。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3-3)中所述pH7.0 Tris-HCl缓冲液为10～50mM的pH 7.0 Tris-HCl缓冲液，其中非离子去垢剂的含量为0.01％～0.05％(w/v)。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蓝藻为鱼腥藻属Anabaena sp.PCC7120。