[发明专利]一种基于mNGS检测COVID-19的方法及其应用

说明书

本发明提供一种基于mNGS的检测COVID‑19新型冠状病毒的方法及其应用，所述方法中通过设计制备COVID‑19新型冠状病毒的多重基因组特异性逆转录引物组，提高了新冠病毒RNA的逆转录效率，降低气溶胶污染问题，同时还提高了对不同变异病毒核酸序列的富集能力。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于mNGS检测COVID-19的方法及其应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎症状与普通肺炎相似，因此快速准确的诊断技术对于患者救治有着至关重要的作用。目前，病情诊断和疫情筛查的主流检测手段是实时荧光RT-PCR检测技术，该技术试验操作简单，检测时间短，灵敏度高，是目前快速诊断和大范围人群筛查的首选。但该技术同样存在着弊端，目前的商业化试剂盒通常以两个新冠病毒特异性基因位点为靶点，仅能检测两个短序列，新冠病毒核酸是RNA，比DNA更容易降解，采样后病毒死亡分裂，RNA完整性下降，检测时如果剩余的核酸不在靶标区域，就会出现假阳，而且新型状病毒在不断变异，一旦样品中靶点区域出现突变，该检测手段也会有漏检的风险。

而基于二代测序的新冠病毒基因组检测序列可覆盖COVID-19序列全长。弥补了RT- PCR只可检测少量COVID-19已知区域的缺点，不但可以提高检测的准确性，而且可以对病毒可能的变异进行鉴别，根据基因型准确判断病情，制定治疗方案，更可以据此追溯来源，摸清传播途径。因此，对新冠病毒的基因组检测作为体外诊断方法已得到了国内医学界的普遍认可，在国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中，新冠病毒的基因组检测和实时荧光RT-PCR一样被定为疑似病例的确诊依据。

常见的基因组测序手段有宏基因组和靶向富集检测两种，但目前宏基因组存在着对样品内全部核酸无差别检测的弊端，高占比的人源核酸不仅降低了检测灵敏度，还会因不同样品的占比差异导致检出信号强度不稳定，产生假阴。而靶向富集多采用多重PCR 的手段富集新冠病毒基因组序列的方法去除人源核酸的干扰，但逆转录后针对cDNA的扩增使用的循环数高，而且，PCR产物易造成交叉污染和气溶胶污染，产生假阳性。而且只针对NCBI提供上的单一参考基因组序列设计引物，必然会把发生变异的基因序列排查在外。新冠病毒变异速度快，序列多样性非常丰富，世界范围内不断有新的病毒亚型被发现和上传，截止目前为止，NCBI收录的新冠病毒基因序列达到50,326条，只针对一个固定的基因组序列设计引物会降低对变异病毒序列的富集效果，造成假阴性。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的是寻求一种有效检测新型冠状病毒COVID-19的方法，为实现改目的，本发明提供如下技术方案：

本发明首先提供一种病毒多重基因组特异性逆转录引物组制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1)生成多重基因组：从基因组数据库下载病毒的N1个基因组序列，将下载的所有基因组序列匹配对齐；所述100＜N1＜1000。

步骤2)制备候选引物组：将匹配好的多重基因组序列分割成有150-300nt(优选197nt)重叠的300-500nt(优选394nt)短片段，在每个片段两端截取30-60nt(优选 50nt)作为引物设计区域，针对该引物设计区域随机设计多个10-15nt(优选13nt) 的正向和/或反向引物，组成该区域待合并引物组；将每个区域待合并引物组的所有引物按出现频率排序(优选从高到低进行排序)，选择出现频率最高且不含不确定碱基的引物，删除与该引物序列相同的所有引物，对剩余的引物再次进行排序筛选，重复 N2次后，得到候选引物组；所述1≤N2≤8。

进一步的，该方法还包括：

步骤3)引物筛选：对候选引物组经二次筛选，删除以下任意或多个情况的引物：Tm值与平均值偏离2个标准差以上、可能形成自身二聚体或交叉二聚体、存在5nt以上的均聚物重复碱基,经筛选剔除得到最终多重基因组逆转录引物组。