[发明专利]一种基于mNGS检测COVID-19的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于mNGS检测COVID-19新型冠状病毒的建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)多重基因组特异性逆转录引物组制备步骤：设计并筛选多重基因组特异性逆转录引物组；

2)逆转录合成cDNA步骤：包括利用设计的多重基因组特异性逆转录引物组进行多重扩增的步骤；

3)文库构建步骤：对逆转录合成的cDNA序列进行文库构建的步骤；

所述2)逆转录合成cDNA步骤中，包括向多重基因组逆转录引物组中添加随机逆转录引物，再进行多重扩增的步骤；

所述2)逆转录合成cDNA步骤中，多重扩增中采用全长逆转录酶进行多重扩增，所述全长逆转录酶为HiScript III Enzyme；

所述多重基因组特异性逆转录引物组的引物序列如SEQ ID NO.1-277所示。

2.权利要求1所述的基于mNGS检测COVID-19新型冠状病毒的建库方法，其特征在于，所述1)多重基因组特异性逆转录引物组的制备包括如下步骤：

步骤1)生成多重基因组：从基因组数据库下载病毒的N1个基因组序列，将下载的所有基因组序列进行匹配对齐；所述N1为：100N11000；

步骤2)制备候选引物组：将匹配好的多重基因组序列分割成有150-300nt重叠的300-500nt短片段，在每个片段两端截取30-60nt作为引物设计区域，针对该引物设计区域随机设计多个10-15nt的正向和/或反向引物，组成该区域待合并引物组；将每个区域待合并引物组的所有引物按出现频率排序，选择出现频率最高且不含不确定碱基的引物，删除与该引物序列相同的所有引物，对剩余的引物再次进行排序筛选，重复N2次后，得到候选引物组；所述N2为：1≤N2≤8；

步骤3)引物筛选：对候选引物组经二次筛选，删除以下任意或多个情况的引物：Tm值与平均值偏离2个标准差以上、可能形成自身二聚体或交叉二聚体、存在5nt以上的均聚物重复碱基,经筛选剔除得到多重基因组逆转录引物组；

步骤4)保守区域引物设计：位于高度保守区域的引物设计区域在所有基因组中的序列一致，针对这类区域，使用Primer3软件在该区域的3’端进行13nt引物设计，删除Tm值与步骤3)中得到的引物组平均值偏离2个标准差以上、可能形成与步骤3)中得到的引物组产生交叉二聚体的引物后，选取软件排序最靠前的引物替换步骤3)引物中相同引物设计区域的引物，形成最终的逆转录引物组。

3.权利要求2所述的建库方法，其特征在于，所述步骤1)中的基因组数据库包括但不限于NCBI GenBank数据库、DDBJ数据库、EMBL数据库；所述步骤1)中的对齐是使用快速傅里叶变换MAFFT将下载的所有基因组匹配对齐。

4.一种COVID-19新型冠状病毒的多重基因组特异性逆转录引物组，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-277所示。