[发明专利]一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法，所述方法包括：接种毕赤酵母进行第一培养，后转接进行第二培养，得到第一菌液；将所述第一菌液进行第三培养，得到第二菌液；将所述第二菌液依次用细胞渗透压保护液、细胞膜透性增强液、细胞稳定液和细胞DNA保护液进行重悬活化，得到感受态细胞。该方法得到的感受态细胞，所述感受态细胞的活性度为85％‑95％，具有极高的转化效率，用质粒(浓度为5ug/ul)转化，可以得到2×10supgt;3/supgt;个转化子；PCR鉴定成功率达到90％以上。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法。

背景技术

甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Pichia酵母表达系统最为人熟知，广泛应用于外源蛋白的表达。毕赤酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点(MCR)3′端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5′端引入了alpha factor(α-factor)用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。进行克隆时，选择EcoRI，只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即完成。另外pPICZ系列选用Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇，同时甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。

Pichia酵母表达系统的步骤包括：第一步，构建载体；第二步，将DNA转化入Pichia酵母中；第三步，挑克隆筛选；第四步，表达；第五步，发酵和产物纯化。

感受态细胞的制备和转化是分子生物学研究的基础实验，可用于基因克隆以及文库构建等研究领域。现有技术中，毕赤酵母感受态不佳时，在转化DNA量较少且长度较长的质粒DNA，或转化连接产物中存在较高含量的杂质时，转化会失败，如何提供一种较佳状态的毕赤酵母感受态细胞，避免转化失败，是本领域人员关注的重点方向。

发明内容

鉴于上述问题，提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种毕赤酵母感受态细胞的制备方法。

本发明实施例提供一种毕赤酵母感受态细胞的制备方法，所述方法包括：

接种毕赤酵母进行第一培养，后转接进行第二培养，得到第一菌液；

将所述第一菌液进行第三培养，得到第二菌液；

将所述第二菌液依次用细胞渗透压保护液、细胞膜透性增强液、细胞稳定液和细胞DNA保护液进行重悬活化，得到感受态细胞。

可选的，所述细胞渗透压保护液的pH范围为7.5-9.0，包括缓冲液、透性化试剂、DNA保护剂和山梨醇溶液，所述细胞渗透压保护液中所述缓冲液、所述二甲基亚砜和所述DNA保护剂的摩尔比例为10-20∶1-1.5∶10-20；所述细胞膜透性增强液的pH范围为7.5-9.0，包括所述缓冲液、醋酸锂、所述DNA保护剂和所述山梨醇溶液，所述细胞膜透性增强液中所述缓冲液、所述醋酸锂和所述DNA保护剂的摩尔比例为10-20∶50-100∶10-20；细胞稳定液包括山梨醇溶液和/或无菌水。

可选的，所述山梨醇溶液为0.8-1.4mol/L，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷，其浓度为8-12mmol/L；所述二甲基亚砜的质量浓度分数为3-5％；所述DNA保护剂包括二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，所述DNA保护剂的浓度为8-12mmol/L；醋酸锂的浓度为75-85mmol/L；细胞DNA保护液包括鲑鱼精DNA和所述山梨醇溶液，所述鲑鱼精DNA的浓度为8-12mg/mL。