[发明专利]共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA-LFD引物、探针及试剂盒

说明书

本发明涉及一种共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA‑LFD引物、探针及试剂盒，属于动物病毒分子生物学检测技术领域。本发明设计了共同检测EHDV和PALV的引物和nfo探针，并在此基础上构建一种能够共同检出流行于中国的EHDV和PALV核酸的RPA‑LFD检测试剂盒，该试剂盒具有特异、敏感、快速、高效以及能够等温扩增并用于现场快速诊断等优势，易于推广应用。

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的重组酶聚合酶-侧流层析试纸检测引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)和帕利亚姆血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)均为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。EHDV和PALV主要通过雌性库蠓(Culicoides spp.)对反刍动物的吸血性叮咬进行传播。EHDV能够导致被感染的白尾鹿发生死亡，以前认为只有属于EHDV-2型的Ibaraki毒株可导致被感染牛出现类似蓝舌病的临床症状，但近年来EHDV-1、-6和-7型病毒在土耳其、以色列和日本流行并且引起奶牛大量减产。EHDV已于2008年被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的跨境动物疫病。而PALV感染则主要导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，PALV相关的疫情曾在日本暴发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征。EHDV和PALV都给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。

EHDV和PALV基因组均由10个节段的双链RNA(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3a)。EHDV和PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，内层衣壳则由Seg-3和Seg-7编码的VP3和VP7构成，而由Seg-1、Seg-4和Seg-9编码的VP1、VP4和VP6以及病毒基因组则共同构成病毒核心。世界范围存在9种EHDV血清型，分别为EHDV-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9和-10型。中国目前有5种血清型EHDV的流行(EHDV-1、-5、-6、-7和-10型)。PALV也具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PA LV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在Chuzanvirus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型PALV的流行。

2013年首次在广西壮族自治区设置的哨兵牛血液样本内分离获得EHDV-5型毒株，随后在广东省和云南省等省份分离到EHDV-1、-6、-7和-10型毒株。EHDV血清学调查显示，EHDV广泛流行于我国南方地区，并呈明显的地域和季节相关性，其中广东省和云南省牛血液样本中EHDV抗体阳性率分别高达65.08％和68.75％。CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，此外多株BCV和DAV则于2012年至2018年在云南省、广西壮族自治区和广东省分离获得，提示多种血清型的PALV流行于我国南方地区。CHUV血清学调查则表明，CHUV已在我国呈广泛分布趋势，海南省牛羊血清抗体阳性率最高可达57.35％，甚至甘肃省牦牛血清内CHUV抗体阳性率也可达7.89％。为了掌握EHDV和PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，非常有必要建立EHDV和PALV的现场快速诊断方法。

已有杨振兴等和李占鸿等分别开发了实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和竞争性ELISA(competitiveELISA,C-ELISA)方法用于EHDV和PALV的检测，但是上述两种检测方法都存在不足之处。