[发明专利]一种改造HTS基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用

说明书

本发明涉及一种改造HTS基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用。本发明的重组棒状杆菌，是在棒状杆菌宿主菌中，替换HTS基因5′端序列中起始密码子ATG前‑19位～‑12位核苷酸序列，降低HTS基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达。该重组棒状杆菌与原始菌株相比，在L‑赖氨酸合成效率上有一定提高，进而提高L‑赖氨酸产量，降低生产成本，而且与现有的高产L‑赖氨酸的改造方法没有冲突，但是与现有的改造方法是否有相互促进的作用，仍需要进一步验证。

技术领域

本发明涉及一种改造HTS基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸是构成蛋白质的基本单位，是合成人体激素、酶及抗体的原料，参与人体新陈代谢和各种生理活动，L-赖氨酸是人体必需氨基酸，在各种氨基酸输液配方中基本上都有。L-赖氨酸最初是从蛋白质水解产物中分离得到的，后又发明了化学合成法、酶法，1960年日本首先采用微生物发酵法生产。L-赖氨酸的生产原料为各种淀粉水解糖或糖蜜，采用短杆菌属和棒杆菌属的变异株发酵生产，通过分离、浓缩、蒸发、结晶、干燥获得饲料级赖氨酸，再精制可得到食品级、医药级赖氨酸。1965年我国全面推广了用发酵法生产谷氨酸的技术，自此以后也带动了发酵赖氨酸的科研和生产。目前，国内赖氨酸产酸率和转化率已经超过20g/dL和60％。

用于生产L-赖氨酸的微生物包括多个种属，例如棒状杆菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，但是，野生型菌株产L-赖氨酸的能力差，代谢副产物多，难以实现高纯度和高产量L-赖氨酸的制备。因此，通常需要获得高产L-赖氨酸的菌株。目前，获得高产L-赖氨酸的菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因工程育种。诱变筛选育种是指通过紫外照射或者其他外界条件刺激，诱导菌株发生不特定的基因位点突变，然后通过筛选获得高产菌株，这种方法缺乏方向性，基因突变位点难以控制，对菌株性能的预期性差。基因工程育种是通过明确的基因改造方式来优化选育菌株，例如通过增加拷贝或者定点突变导入酶活性高的有益酶基因，或者通过敲除不利基因使酶活性/表达消失。目前，谷氨酸棒状杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA认证为“generally regarded assafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒状杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。

基因5′端序列一般是指位于结构基因5′端上游，通常包含有RNA聚合酶识别、结合和起始转录位点的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，其本身不被转录。它的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于基因5′端序列内部，长度因生物种类而异，一般不超过200bp，是典型的顺式作用元件，与转录因子(反式作用因子)相结合调控基因表达的水平、部位及方式(中国专利文献CN109385424A)。基因5′端序列替换可被用于以特定的方式调节基因的表达，如它们的条件表达或过表达。以PCR为基础的基因靶向，通过同源重组实现开放阅读框(ORF)上游调控序列的染色体整合，可以使基因组发生稳定的改变(中国专利文献CN111655860A)。

虽然目前已有很多关于提高L-赖氨酸产量的报道，但是开发新的提高L-赖氨酸产量的方法仍然有其必要性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种改造HTS基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用。本发明的重组棒状杆菌是通过基因工程改造棒状杆菌宿主菌获得，具体策略为运用基因5′端序列替换的方法替换4-羟基-四氢二吡啶酸合酶(4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase，HTS)基因5′端序列中的部分核苷酸序列，获得高产L-赖氨酸的重组棒状杆菌。

术语说明：

4-羟基-四氢二吡啶酸合酶(4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase，HTS)：催化天冬氨酸半醛形成二氢吡啶二羧酸，是一种在L-赖氨酸合成途中起着重要作用的酶，广泛存在于多种细菌微生物中。