[发明专利]一种改造HTS基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用

权利要求书

1.一种改造HTS基因5′端序列的重组棒状杆菌，其特征在于，是在棒状杆菌宿主菌中，将HTS基因5′端序列中起始密码子ATG前-19位~-12位核苷酸序列^-19GAAGGTAA ^-12替换为^-19TGTGGTAT ^-12，降低HTS基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达；其中，所述棒状杆菌宿主菌为谷氨酸棒状杆菌CICC23604，所述谷氨酸棒状杆菌CICC23604的HTS的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述谷氨酸棒状杆菌CICC23604的HTS的核苷酸序列为SEQID NO.2，所述谷氨酸棒状杆菌CICC23604的HTS基因5′端序列为SEQ ID NO.3；或者，所述棒状杆菌宿主菌为谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647，所述谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647的HTS的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，所述谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647的HTS的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，所述谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647的HTS基因5′端序列为SEQ ID NO.10。

2.权利要求1所述的重组棒状杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成上游同源臂-^-19TGTGGTAT ^-12-下游同源臂的核苷酸序列，其中上游同源臂和下游同源臂为HTS基因5′端序列中起始密码子ATG前-19位~-12位核苷酸序列^-19GAAGGTAA ^-12的前后各一段长度500~600bp的核苷酸序列；

（2）将上游同源臂-^-19TGTGGTAT ^-12-下游同源臂的核苷酸序列连接至pK19mobsacB载体中，构建替换载体；

（3）将替换载体转化棒状杆菌宿主菌感受态细胞，筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，获得发生了第一次同源单交换的重组菌；

（4）将发生了第一次同源单交换的重组菌自然传代后，筛选能在10%蔗糖培养基生长但不能在具有卡那霉素抗性的培养基生长的菌落，验证后得到完成两次同源单交换的重组棒状杆菌。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i. 步骤（2）中上游同源臂-^-19TGTGGTAT ^-12-下游同源臂的核苷酸序列连接至pK19mobsacB载体的Hind III、EcoR I酶切位点之间；

ii. 步骤（3）中以卡那霉素抗性基因引物采用PCR扩增技术筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，所述引物序列如下：

F1：5′- ATGATTGAACAAGATGGATTGC -3′，

R1：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3′；

所述PCR扩增的体系为：2×HiFi-PCRmaster 10μL，10μmol/L上游引物 1μL，10μmol/L下游引物 1μL，模板 1μL，ddH₂O 7μL；

所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

iii. 步骤（4）所述验证是采用PCR扩增技术验证，PCR扩增的引物序列如下：

F2：5′-AAATGAGGGAATGTGGTAT-3′，

R2：5′-TTATAGAACTCCAGCTTTTTTCA-3′；

所述PCR扩增的体系为：2×HiFi-PCRmaster 10μL，10μmol/L上游引物 1μL，10μmol/L下游引物 1μL，模板 1μL，ddH₂O 7μL；

所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

iv. 步骤（4）中所用培养基为LBG培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10g/L。