[发明专利]热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。所述葡萄糖氧化酶突变体通过将氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的葡萄糖氧化酶的第4位、第70位、第86位、第96位、第274位、第508位中至少一个氨基酸进行取代获得。本发明提供葡萄糖氧化酶突变体，与野生型葡萄糖氧化酶相比，其热稳定性有了显著的提升，有利于该酶在工业化生产中应用。本发明对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，通过定点突变技术和易错PCR方法提高了葡萄糖氧化酶的热稳定性，为葡萄糖氧化酶的工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4，GOD)作为一种高特异性氧化还原酶，能够催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸，并产生过氧化氢(H₂O₂)，在医疗检测、食品、生物燃料电池、畜牧养殖等领域发挥着极其重要的作用。葡萄糖氧化酶作为一种新型的绿色添加剂有其独特的作用方式，与普通酶制剂不同，它并不是通过改善营养素的消化利用和减轻抗营养因子的方式来改善对其动物生产性能的影响。其方式可能是一方面通过与饲料中葡萄糖作用而产生的葡萄糖酸来发挥作用，另一方面，葡萄糖氧化酶在与葡萄糖作用过程中消耗O₂，使消化道更易形成厌氧环境，促使厌氧有益菌的增殖。综合起来，葡萄糖氧化酶通过在肠道中的作用而可能起到酸化剂和益生菌的作用。

GOD广泛分布于动植物和微生物体内，由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶具有较差的热稳定性，当温度超过65℃时，葡萄糖氧化酶的酶活快速下降，而饲料制粒过程的温度在75℃以上，葡萄糖氧化酶较差的热稳定性已成为阻碍其广泛应用的关键因素。因此，提供热稳定的葡萄糖氧化酶性具有重要的应用价值，将带来巨大的市场竞争力。如何更有效地提高葡萄糖氧化酶耐热性能也是今后研究的方向。随着研究的不断深入，葡萄糖氧化酶的应用前景将会更加广阔。

CN 103981159A公开了一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用，通过将第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn，提高了突变酶的耐热性。

目前大多数酶反应需要在较温和的条件下进行以维持其正常活性，而在实际应用的逆境中(如高热、高酸、高盐等)，酶的耐受性却较差、容易失活从而导致反应效率下降，极大地限制了其推广和应用。因此，对酶分子进行抗逆改造以提高其稳定性和催化活性，是当前研究的热点也是难点。本发明的葡萄糖氧化酶突变体对于拓宽葡萄糖氧化酶的实际应用具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供葡萄糖氧化酶突变体。

本发明的再一目的是提供葡萄糖氧化酶突变体编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组菌株。

根据本发明提供的热稳定性提高的葡萄糖氧化酶，基于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的葡萄糖氧化酶的第4位、第70位、第86位、第96位、第274位、第508位中至少一个氨基酸发生了突变。

根据本发明的具体实施方案，所述突变为I4A、I4P、I4Y、D70Q、D70K、A86F、A86*(第86位氨基酸被删除)、A86Q、S96A、S96N、S96F、G274S、G274Q、G274H、P508A、P508H或P508C中之一或多个组合。

在本发明的优选具体实施方案中，所述取代为I4A、D70K、A86*、S96A、G274Q、P508H。

在本发明的优选具体实施方案中，所述取代为I4P、D70K、A86F、S96A、G274S、P508A。