[发明专利]一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用

说明书

本发明属于线粒体控制区研究领域，涉及一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用。扩增引物由两条单链寡核苷酸组成，其中上游引物CGU‑dlp‑S有25个碱基：AAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAGA，下游引物CGU‑dlp‑A有21个碱基：CTCACGGGGTTGCGGAGACTT。本发明的扩增引物可以高效特异性地扩增圆口铜鱼线粒体基因组控制区，可用于不同地区圆口铜鱼线粒体控制区序列的遗传信息分析，为快速有效地进行种类鉴定、遗传分化、控制区进化研究提供了一个有力工具。

技术领域

本发明涉及圆口铜鱼遗传信息分析技术领域，具体的说，涉及一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用。

背景技术

动物线粒体基因组DNA是细胞核外呈共价闭合结构，拷贝数高、分子量小而稳定、无组织特异性、一级结构进化速度快等，具有自主复制、转录和翻译能力，并严格进行母系遗传的遗传因子，已成为鱼类生态学和进化生物学研究的有力工具。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区，即控制区组成，不同区域进化速率不同。一般认为，控制区是线粒体基因组上进化最快的区域，其变异速率约为线粒体DNA上其他区域的5-10倍，适于亲缘关系较近的群体间进行比较研究，是进行鱼类群体遗传结构分析、种类鉴定及濒危物种遗传多样性检测等方面研究的重要遗传标记。

圆口铜鱼(Coreius guichenoti)，隶属鲤形目Cypriniformes，鮈亚科Gobioninae，铜鱼属Coreius，是一种主要分布于长江上游、金沙江中下游及其部分支流如雅砻江下游的特有鱼类，根据2021年1月4日公布并实施的《国家重点保护野生动物名录》，圆口铜鱼被增补为国家二级重点保护野生动物。圆口铜鱼属于典型的河道洄游性鱼类，成熟亲鱼向上溯游到金沙江中下游产卵，受精卵在天然河道中漂流发育、完成孵化过程并具有主动游泳能力，整个生活史均需在河道中完成。随着长江上游干支流梯级电站建设的逐步实施，圆口铜鱼栖息地面积日益缩小，且生境相互隔离，已建成的水利工程阻隔了圆口铜鱼补充群体的洄游通道。因此，对圆口铜鱼的研究和保护工作迫在眉睫。目前已报道的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物(黄志坚等)和鲤科鱼类线粒体DNA控制区扩增引物(刘焕章)，均不能有效扩增不同地区圆口铜鱼样品，大部分没有扩增产物。因此针对圆口铜鱼线粒体DNA控制区序列设计特异性引物，为有效获得不同地区圆口铜鱼线粒体控制区序列、进行不同地区群体间遗传结构比较研究、多样性检测及有效避免人工增殖放流造成的遗传污染是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物，上游引物CGU-dlp-S有25个碱基，如SEQ ID NO:1所示，下游引物CGU-dlp-A有21个碱基，如SEQ ID NO:2所示：

SEQ ID NO:1：AAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAGA；

SEQ ID NO:2：CTCACGGGGTTGCGGAGACTT。

提供一种上述圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物的应用，用于不同地区圆口铜鱼线粒体控制区序列的遗传信息分析。

按上述方案，所述应用包括以下步骤：

(1)提取圆口铜鱼基因组DNA；

(2)在上游引物CGU-dlp-S和下游引物CGU-dlp-A的作用下进行PCR反应；

(3)琼脂糖凝胶电泳；

(4)对扩增的mt DNA控制区基因片段进行测序，对测序结果进行手动校正后，计算单倍型多样性和核苷酸多样性，用来衡量圆口铜鱼遗传多样性水平；计算群体间的分化指数(Fst)值并进行分子方差分析(AMOVA)，用来判断各圆口铜鱼不同地区群体间遗传分化情况。