[发明专利]产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明采用裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21为野生型菌株，在大肠杆菌中构建以延长酶基因(elogase，elo1)两端序列为同源臂、博来霉素为筛选标记的elo1基因敲除载体pBlue‑ZEO‑elo1和以18sRNA为同源臂、潮霉素为筛选标记的磷脂酸磷酸酶基因(phosphatidic acid phosphatase，pap)干扰载体pBlue‑HYG‑siRNA‑18s，将两个载体同源重组结构域线性化后电转进入裂殖壶菌内，得到一株elo1基因敲除结合pap基因干扰的高产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株，命名为MIX菌株。本发明通过调控相关基因的表达水平改变了碳代谢流向，抑制了裂殖壶菌油脂合成的能力，为角鲨烯合成提供了更多的碳通量。本发明为裂殖壶菌实现多基因改造提供了理论依据，同时为裂殖壶菌生产角鲨烯奠定了实验基础。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及裂殖壶菌基因工程菌株。

背景技术

角鲨烯(Squalene)作为一种重要的萜类化合物，具有降血脂、防癌和抗氧化等功效，因此广泛应用于医疗保健领域。由于自然资源的限制和化学合成的困难，利用微生物发酵生产角鲨烯已经成为主要趋势。生物合成法具有易操作、周期短以及转化率高的优点，同时通过微生物发酵获得的产物易于分离纯化，具有良好的经济效益。生物合成法的技术重点是筛选出适合角鲨烯生产的并且具有经济价值的菌种。目前用于角鲨烯合成的菌种主要包括破囊壶菌、酵母、大肠杆菌和自养型微藻等。Nakazawa等人从海水中筛选出来的破囊壶菌18W-13a角鲨烯产量可以达到1.29g/L。Liu等人优化后的酿酒酵母角鲨烯产量达到11.00g/L，是目前已知基因工程菌株的最高产量。Li等从香港红树林中分离得到的自养型微藻Aurantiochytrium mangrovei FB1角鲨烯的产量极易受培养条件的影响，无法准确掌握角鲨烯产量最高的培养时间，产量仅有0.53mg/g。Xu等人通过基因改造将真菌甲羟戊酸途径相关的基因导入大肠杆菌中表达，角鲨烯产量达到52.1mg/L，实现了大肠杆菌基因工程菌株产角鲨烯的重大突破。

裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)又名裂壶藻，是一种海洋真菌，隶属于真菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目和破囊壶菌科。裂殖壶菌生长速度快，发酵周期短，耐机械搅拌，是一种食品安全菌。其代谢途径可以合成多种高值化合物，包括磷脂、多不饱和脂肪酸、角鲨烯、类胡萝卜素、叶黄素和虾青素等。裂殖壶菌是具有高产角鲨烯潜力的优良菌株，但目前关于裂殖壶菌生产角鲨烯的研究主要停留于培养条件的优化阶段，代谢途径调控研究报道较少。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

首先，本发明提供了一种产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株，所述菌株是选用产油Schizochytrium limacinum SR21为材料构建而成，所述菌株基因组中延长酶基因(elogase，elo1)被敲除，同时磷脂酸磷酸酶基因(phosphatidic acid phosphatase，pap)被干扰表达。

其中，所述elo1基因和pap基因克隆于野生型菌株Schizochytrium limacinumSR21的基因组。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

其次，本发明提供了提供一种产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，为双基因改造方法，该方法包括如下步骤：

(1)克隆来源于野生型菌株Schizochytrium limacinum SR21基因组中elo1基因的上下游同源臂，插入pBlue-ZEO-18s质粒的同源重组区域，构建以博来霉素为抗性的elo1基因敲除载体pBlue-ZEO-elo1；