[发明专利]产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株选用Schizochytrium limacinum SR21为材料构建而成，所述基因工程菌株的基因组中elo1基因被敲除，同时pap基因被干扰表达；所述基因工程菌株通过以下构建方法得到：

1)克隆来源于Schizochytrium limacinum SR21基因组的elo1基因的上下游同源臂，插入pBlue-ZEO-18s质粒的同源重组区域，构建以博来霉素为抗性的elo1基因敲除载体pBlue-ZEO-elo1；

所述elo1基因上下游同源臂的构建方法包括：根据Schizochytrium limacinum SR21基因组的elo1基因的序列信息，设计如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的上游同源臂扩增引物P1、如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的下游同源臂扩增引物P2；以Schizochytriumlimacinum SR21基因组为模版，用所述引物P1和所述引物P2通过PCR方式获得elo1基因上下游同源臂；

所述pBlue-ZEO-elo1载体的构建方法包括：用HindⅢ和KpnⅠ对pBlue-ZEO-18s和所述elo1基因上下游同源臂进行双酶切，连接，转化至大肠杆菌Trans110感受态细胞，获得所述pBlue-ZEO-elo1；

2)将来源于野生型菌株Schizochytrium limacinum SR21基因组的pap基因的siRNA连接到真菌干扰质粒p-Silent-HYG的多克隆区域，利用PCR的方式扩增出潮霉素抗性表达框和siRNA的表达框；将该含有潮霉素抗性表达框和siRNA的表达框的片段整合进过表达质粒pBlue-ZEO-18s的多克隆区域，替换博来霉素表达框和过表达基因表达框，构建出以潮霉素为抗性，以18s-rRNA基因序列为同源臂的pap基因干扰载体pBlue-HYG-siRNA-18s；

所述pBlue-HYG-siRNA-18s的构建方法包括：以如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物P3构建编码pap基因敲除siRNA的DNA片段；用XhoⅠ和HindⅢ对真菌沉默质粒p-Silent-HYG进行双酶切后，与所述DNA片段连接，转化至大肠杆菌Trans110感受态细胞，获得p-Silent-siRNA重组质粒；以所述p-Silent-siRNA为模板，以如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物P4扩增出p-Silent-siRNA质粒上的潮霉素抗性表达框和siRNA表达框；用SpeⅠ和HindⅢ对所述pBlue-ZEO-18s进行双酶切，与所述扩增的产物连接，转化至大肠杆菌Trans110感受态细胞，获得所述pBlue-HYG-siRNA-18s重组载体；

3)制备裂殖壶菌感受态细胞，将构建好的两重组载体分别酶切线性化，并电转入裂殖壶菌内，通过博来霉素和潮霉素抗性筛选和鉴定，获得elo1基因敲除结合pap基因干扰的所述产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述步骤3)中，将所述pBlue-ZEO-elo1和所述pBlue-HYG-siRNA-18s分别酶切线性化后，加入到裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21的感受态细胞，电转，培养获得所述产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株。

3.一种应用权利要求1或2所述的基因工程菌株生产角鲨烯的方法，其特征在于：将所述产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基，26～30℃逐级放大培养获得发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种于发酵培养基中，26～30℃进行发酵培养；收集发酵培养产物，提取得到角鲨烯。