[发明专利]一种基于生物基因的PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种基于生物基因的PCR检测方法，该生物基因的PCR检测方法包括如下步骤：设计特异性引物；提取细菌基因组DNA；优化PCR扩增条件；特异性试验；灵敏度试验和模拟污染试验。该生物基因的PCR检测方法具有特异性强、敏感度高和简便快捷的特点，以胎儿弯曲菌的蛋白基因为靶基因，应用软件设计特异性引物，并且通过反应条件的优化、引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测，建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法，为以后临床样品检测提供了技术支持，同时，对识别胎儿弯曲菌菌株的暴发流行，相关疾病的诊断和控制具有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种基于生物基因的PCR检测方法。

背景技术

弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。除可引起腹泻外，还可造成不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。对人除可引起腹泻和食物中毒外，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。

引起动物和人类疾病的主要是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌。弯曲菌的菌体纤细，呈螺旋形、撇行、S形和鸥形等多种形态。在老龄培养物中呈螺旋状长丝或圆球形，运动力活泼。革兰氏染色阴性，微需氧，对营养要求较高。在含10％二氧化碳的环境中生长良好，于培养基内添加血液、血清有利于初代的培养。

人感染后，潜伏期一般为3～5d，病情轻重不一。典型病人先有发热，全省无力，头痛，肌肉酸痛，婴儿还可发生抽搐临诊症状。继而腹痛，常局限于脐周，呈间歇性，有的呈隐痛，排便后可缓解。发热12～24h后开始腹泻，呈水样，每天排便5～10次，1～2d后部分病例出现黏液便或脓血便，经过1周可自行缓解，少数病例腹痛可持续数周，反复发生腹泻。近年来，弯曲菌常引起儿童肠道外感染，如败血症、脑膜炎、胆囊炎、腹膜炎、心内膜炎、血栓性静脉炎和反应性关节炎等。

根据流行病史和临诊表现可怀疑为本病，确诊需进行细菌的分离鉴定。但细菌分离需要耗时2～7d才能确诊，胎儿弯曲菌的危害比较严重，而人们对于胎儿弯曲菌的特性却掌握得很少。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于生物基因的PCR检测方法，基于物种特异性PCR技术，建立胎儿弯曲菌特性快速检测的体制。

本发明提出的一种基于生物基因的PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一：设计特异性引物：从基因库中获取胎儿弯曲菌的特异性基因序列，打开软件primer premier5.0设计特异性引物，引物要求与基因库中胎儿弯曲菌的同源性为100％；

步骤二：提取胎儿弯曲菌基因组DNA；将胎儿弯曲菌接种放在无血弯曲菌琼脂中进行培养，微氧条件下进行培养，随后挑选菌落。并将其加入到培养基中并用移液枪吹匀，沸水煮沸过后取出立即放置在冰上，离心，吸取上清液并转移保存备用，同时提取两份细菌基因组DNA用于特异性试验、灵敏度试验和模拟污染试验；

步骤三：优化PCR扩增条件；取胎儿弯曲菌的DNA模板和PCR预混液，上下游引物和灭菌去离子水混合在试管中并做离心处理，反应物集中到试管底部后进行PCR扩增；

步骤四：特异性试验；用引物对胎儿弯曲菌进行PCR检测，并通过电泳实验对其进行观察；

步骤五：灵敏度试验；用分光光度计测定胎儿弯曲菌的DNA模板的浓度后，分别梯度稀释，每个梯度各取来进行PCR扩增，并通过电泳观察比较条带亮度，直至不出现条带；

步骤六：模拟污染试验。用磷酸缓冲盐溶液作梯度稀释，同时每个梯度做菌落技术，然后将每个稀释度各取菌液分别加入到污水，的奶牛粪便样品中，向样品加入增菌培养基，摇床培养，再提取DNA，再用PCR方法对阳性菌落进行计数。