[发明专利]中华鲟环境DNA数字PCR检测方法

说明书

本发明涉及中华鲟环境DNA数字PCR检测方法。以提取的环境DNA为模板，使用中华鲟环境DNA数字PCR体系进行目的片段的数字PCR扩增；扩增完成后，将反应板置于生物芯片阅读仪中进行检测，数据分析软件读取结果，显示反应体系拷贝数。本发明可以定量检测大型河流水样中的中华鲟环境DNA，无需接触鱼类个体，对生物体无损伤，对环境无负面影响，采样方法简单快捷，检测体系灵敏度高，绝对定量准确度高。为大型河流中种群密度低的珍稀濒危鱼类中华鲟的群体监测提供了高效、准确且非入侵式的调查方法，用于中华鲟聚集地调查和资源量动态监测。

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及一种中华鲟环境DNA数字PCR检测方法。

背景技术

中华鲟(Acipenser sinensis)是国家一级保护动物，种群严重衰退，自然繁殖已连续中断4年(2017-2019年)，2020年葛洲坝下产卵场江段中华鲟繁殖群体数量仅十余尾。群体动态和繁殖行为监测是中华鲟物种保护的基础，仅依靠传统调查方法难以获取充足数据，且调查准确度亟待加强。长江环境DNA物种检测技术近年来逐渐发展，通过采集水体样本提取环境DNA，利用特定分子标记进行水生生物检测，具有无损伤、采样简单高效、检测灵敏度高、物种鉴定准确等优势。用于组织DNA的常规引物通常目的片段较长，对部分降解的环境DNA难以扩增成功，研究开发针对目标物种的特定位点，设计短片段扩增引物，筛选可稳定扩增的分子标记，并进一步地研究开发适用于中华鲟环境DNA的检测方法具有重要的意义。

发明目的

本发明所要解决的技术问题是，设计筛选可靶定中华鲟线粒体DNA且适用于水体环境DNA扩增的引物和探针，建立高敏感度的数字PCR(Digital PCR，dPCR)扩增体系，提供一种快速高效的中华鲟环境DNA检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

提供一种适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物，引物序列为：

正向引物ND2-F序列为：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’，反向引物ND2-R序列为：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’。

提供一种中华鲟环境DNA数字PCR体系，包括上述适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物和荧光探针5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，荧光探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

上述荧光报告基团具体可为FAM、VIC。

荧光淬灭基团具体可为MGB、BHQ₁。

按上述方案，上述中华鲟环境DNA数字PCR体系还包括超敏微滴式数字PCR反应预混液。

按上述方案，所述的PCR扩增反应条件为：95℃10min；95℃30s，60℃60s，45个循环；98℃10min。

按上述方案，上述中华鲟环境DNA数字PCR体系每20μL反应体系包括：超敏微滴式数字PCR反应预混液5μL，正反向引物(10uM)各1.8μL，探针(10uM)0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O8.9μL。

按上述方案，步骤(2)中PCR扩增结果存在阳性微滴的样本则为阳性样本，表明该样本中检测到目标DNA片段，该采样点江段附近存在中华鲟繁殖群体分布；反应体系拷贝数换算出的环境DNA浓度(copy/mL)，表明水样中目标DNA的浓度，进行PCR定量检测。在采样时间和环境条件相同的情况下，目标环境DNA浓度与物种生物量相关，环境DNA浓度高，表明有更多个体在该区域分布。不同采样时间或不同环境条件影响下，需综合考虑其它影响因素来判断群体分布和资源量。

提供中华鲟环境DNA数字PCR检测方法，包括以下步骤：