[发明专利]一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法

说明书

本发明公开了一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法，肉瘤细胞培养基包括：DMEM/F12基础培养基、1.5‑2.5v/v％FBS、0.5‑1.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5‑1.5mM、氢化可的松20‑40nM、3‑6ng/ml FGF2、EGF 40‑60ng/ml和Hippo抑制剂。采用该培养基体外生产Matrigel原液时，将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，3D生物支架的孔径能够使得小鼠肉瘤细胞维持其三维生长状态，然后对小鼠肉瘤细胞进行培养和扩增，制备Matrigel原液。该制备工艺时间短，所用小鼠量少，可大大降低批次间的差异性。

技术领域

本发明涉及Matrigel的制备技术领域，具体涉及一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法。

背景技术

Matrigel是一种从富含细胞外基质的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等几乎所有的细胞外基质成分。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，广泛应用于干细胞分化、培养、类器官培养等研究中。然而现有的Matrigel制作技术，严重依赖于小鼠动物模型，需要将EHS小鼠肉瘤接种到C57BL6N小鼠皮下，等待大概2-3个月时间，再将接种的肉瘤取出，进行分离、纯化出Matrigel原液。整个过程耗时较长，费用较高，而且需要用到大量的小鼠，导致不同批次的Matrigel存在生物活性差异较大的问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法，以解决现有技术存在的制备时间长，不同批次之间差异大的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种肉瘤细胞培养基，包括：DMEM/F12基础培养基、1.5-2.5v/v％FBS、0.5-1.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5-1.5mM、氢化可的松20-40nM、3-6ng/ml FGF2、EGF 40-60ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 8-12μM。

采用上述技术方案的有益效果为：该培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后加入FBS，FBS中含有血浆蛋白、多肽，生长因子，激素等，可促进肉瘤细胞生长和存活，并且可提供基础培养基中没有或量很少的营养物；ITS中除了含有胰岛素和转铁蛋白以外，还含有硒，可为基础培养基补充其他微量元素，在肉瘤细胞的增殖中发挥着重要；丙酮酸钠可作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是在培养基中加入丙酮酸钠后，当培养基中没有葡萄糖时，细胞也可以代谢丙酮酸钠，为其生长提供能量；培养基中再加入氢化可的松、生长因子FGF2、EGF，其协同基础培养基、FBS、ITS、丙酮酸钠共同提升肉瘤细胞的增殖效率和活性，此外，Hippo抑制剂I3MT-3可用于扩大肉瘤细胞的体积，使得肉瘤细胞快速扩增变大，缩短收获细胞的时间，进而用于制备Matrigel原液。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，一种肉瘤细胞培养基，包括：DMEM/F12基础培养基、2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。

采用上述技术方案的有益效果为：各组分之间相互协同作用，搭配最佳浓度，可更有效加快细胞培养和增殖速率。

采用上述培养基体外生产Matrigel原液的方法，包括以下步骤：

将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，然后在上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞制备Matrigel原液，具体为：

(1)对小鼠肉瘤细胞进行分离纯化；