[发明专利]一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法

权利要求书

1.一种肉瘤细胞培养基，其特征在于，包括：DMEM/F12基础培养基、1.5-2.5v/v％FBS、0.5-1.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5-1.5mM、氢化可的松20-40nM、3-6ng/ml FGF2、EGF 40-60ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 8-12μM。

2.根据权利要求1所述的肉瘤细胞培养基，其特征在于，包括：DMEM/F12基础培养基、2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。

3.采用权利要求1或2所述的肉瘤细胞培养基体外生产Matrigel原液的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，然后在上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞制备Matrigel原液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体过程如下：

(1)对小鼠肉瘤细胞进行分离纯化；

(2)将分离纯化后的小鼠肉瘤细胞与3D生物支架混合，得混合液，将混合液滴入CaCl₂溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再将肉瘤细胞凝胶微球加入上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞；

(3)将收获的细胞进行离心、裂解、除上清，最后重悬，制得Matrigel原液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体过程为：将小鼠肉瘤细胞用胰酶消化，然后对其吹打，终止消化，将消化后的细胞离心，收集沉淀，并对沉淀进行重悬，再离心，收集沉淀，得分离纯化后的小鼠肉瘤细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的3D生物支架为海藻酸钠。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体过程为：将分离纯化后的小鼠肉瘤细胞与0.5-1.5wt％的海藻酸钠混合，得混合液，将混合液滴入0.05-0.15mol/L的CaCl₂溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再将肉瘤细胞凝胶微球加入肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，培养温度为35-40℃，CO₂浓度为5％，培养12-16天，收获细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中海藻酸钠的浓度为1wt％。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中CaCl₂溶液的浓度为0.1mol/L。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体过程为：将收获的细胞于150-250g的速度离心8-15min，然后加入3-4.5mol/L NaCl裂解缓冲液，混匀后，以6000-8000g的速度离心10-20min，去除上清，并重复1-2次，再采用TBS缓冲液重悬，制得Matrigel原液。