[发明专利]一种超高通量单细胞测序方法

说明书

本发明公开了一种超高通量单细胞测序方法，本发明超高通量单细胞测序方法通过分子标记微珠、反转录序列、桥连引物的使用，先使用反转录序列对细胞内进行一次细胞内反转录，再将经细胞内反转录后的细胞通过微孔板技术或微流控技术使一个分子标记微珠与一个或多个细胞处于分隔的空间中，并在裂解液作用下裂解细胞，反转录后得到的序列在桥连引物的帮助下与分子标记微珠上的分子标记序列连接，并通过PCR扩增获得大量序列，构建获得cDNA测序文库，然后进行高通量测序，一次测序便可以获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。大大提高了单细胞测序的通量。

技术领域

本发明涉及单细胞测序技术领域，特别是涉及一种超高通量单细胞测序方法。

背景技术

自2009年汤富酬提出单细胞测序技术以来，单细胞高通量测序平台就如雨后春笋般不断涌现，例如以微流控为主的Drop-seq(Macosko,E.Z.,et al.,Highly ParallelGenome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using NanoliterDroplets.Cell,2015.161(5):p.1202-1214.)和inDrop-seq(Klein,Allon M.,et al.,Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic StemCells.Cell,2015.161(5):p.1187-1201.)平台，以微孔板为主的Microwell-seq(Han,X.,et al.,Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq.Cell,2018.173(5):p.1307.)和Seq-well(Gierahn,T.M.,et al.,Seq-Well:portable,low-cost RNAsequencing of single cells at high throughput.Nat Methods,2017.14(4):p.395-398.)平台以及常见的商用平台10×Gennomics。然而，以微孔板为例，当细胞投入量达到一定程度时，容易出现一个微孔中含有两个甚至更多细胞的情况出现，导致细胞与细胞间转录本的污染。为了避免这种现象的产生，通过分析发现当微孔板中细胞的落孔率约为微孔板总孔数的1/10时，可实现每个微珠仅捕获一个细胞。但这样会导致大量的液滴或者微孔仅仅只有空微珠而没有细胞，大大降低了实验的效率，增加了实验成本，导致这些平台单次实验的细胞通量只能以万为单位。然而，以小鼠和人为例，单个物种个体的细胞总量超过万亿，当下平台通量远远达不到测序的要求，测序通量的不足容易丢失大量的生物信息，因此提高单次测序的通量显得尤为重要。

近年来以单个细胞为独立反应体系的超高通量技术也在不断发展，例如sci-RNA-seq([1]Cao,J.,et al.,Comprehensive single-cell transcriptional profiling of amulticellular organism.Science,2017.357(6352):p.661-667.[2]Cao,J.,et al.,Thesingle-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis.Nature,2019.566(7745):p.496-502.)和SPLiT-seq(Rosenberg,A.B.,et al.,Single-cellprofiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-poolbarcoding.Science,2018.360(6385):p.176-182.)，他们首先将新鲜细胞固定打孔，利用反转录给每一个细胞带上一轮独有的分子标记，随后利用split-pool再给细胞带上不同的分子标记，最终通过分子标记的多重组合使得每一个细胞中的转录本带上独有的分子标记，大大提升了单次实验的通量。但由于这些方法是基于细胞体内的连接反应，存在反应效率低、细胞与细胞之间的转录本易泄露导致污染率较高等问题，降低了方法的实用性。