[发明专利]一种超高通量单细胞测序方法

权利要求书

1.一种超高通量单细胞测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）准备如下试剂：

a）分子标记微珠，所述分子标记微珠包括微珠本体和耦联的分子标记序列，该分子标记序列包括顺序排列的：

通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；

第一细胞标签序列；

第一搭桥序列；

b）反转录序列，用于细胞内反转录，所述反转录序列包括顺序排列的：

第二搭桥序列；

第二细胞标签序列，与第一细胞标签序列配合组成细胞标签序列，所述细胞标签序列用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA取自的细胞；

分子标签序列，用于标识所构建测序文库中各序列所对应的mRNA；

多聚T尾，用于与细胞中带有poly-A序列的mRNA互补配对；

c）桥连引物，用于将上述a）中的标记序列与b）中的反转录序列进行连接，所述桥连引物两端具有分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对的序列；

（2）取待测序的细胞样品，加入反转录序列进行细胞内反转录，使反转录序列的多聚T尾端连上将细胞内mRNA序列反转录后得到的cDNA序列，获得反转录序列-cDNA序列；

（3）将步骤（2）经细胞内反转录后的细胞通过微孔板技术使一个分子标记微珠与一个或多个细胞处于分隔的空间中，并在裂解液作用下裂解细胞，孵育，通过桥连引物分别与所述第一搭桥序列和第二搭桥序列互补配对，然后使用连接酶连接，使第一搭桥序列和第二搭桥序列连接获得与微珠耦联的分子标记序列-反转录序列-cDNA序列，其中所述裂解液的组分为：ddH₂O，1％SDS，50％甲酰胺和3×SSC；

（4）收集耦联有分子标记序列-反转录序列-cDNA序列的微珠，进行PCR扩增获得带有第一细胞标签序列、第二细胞标签序列和分子标签序列的cDNA序列；

（5）将步骤（4）获得的产物构建cDNA测序文库，然后进行高通量测序，获得上百万个单细胞的特异性转录组信息。

2.如权利要求1所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述微珠与分子标记序列耦联方式为：分子标记序列5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基，微珠表面修饰有羧基，通过羧基与氨基缩合耦联。

3.如权利要求1所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标签序列至少部分为随机合成的随机序列。

4.如权利要求3所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述第一细胞标签序列包括多个位置的特异性片段，所述第二细胞标签序列包括至少一个位置的特异性片段，不同位置的特异性片段选自相同的或不同的特异性片段库，所述第一细胞标签序列和第二细胞标签序列利用不同位置的特异性片段的排列组合方式不同标识细胞。

5.如权利要求4所述的超高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述分子标记微珠的制备方法包括以下步骤：

（1）用于合成分子标记序列的引物根据特异性片段的数量分为多条引物，每条引物包含一条特异性片段，各引物之间具有用于搭桥连接、互补的接头序列，其中对应于分子标记序列5’端的那条引物还包括所述通用引物序列，对应于分子标记序列3’端的那条引物还包括所述第一搭桥序列；

（2）将对应于分子标记序列5’端的那条引物与微珠本体耦联，然后通过PCR方法将剩余引物依次退火、延伸，从5’端到3’依次串接分子标记序列的其余特异性片段，制备得到所述分子标记微珠。