[发明专利]一种多重巢式PCR方法

说明书

一种多重巢式PCR方法，涉及基因标志物检测技术领域，本发明利用多重PCR和巢式PCR相结合，利用4种目的基因的基因标志物，设计全新的PCR引物，针对cfDNA5hmC富集捕获文库，使用touchdownPCR及热启动PCR方法进行多重巢式PCR扩增，避免PCR过程中引物二聚体、发夹结构的形成，保证了PCR扩增的特异性，进而完成靶序列的富集，得到二代测序靶向测序文库；通过对4个目的基因的羟甲基化状态的高效检测，实现在较低测序深度下完成对基因标志物中5hmC含量的检测，从而大幅降低测序成本，成为一种高效率、低成本的肝癌早期诊断检测手段。

技术领域

本发明涉及基因标志物检测技术领域，尤其涉及一种多重巢式PCR方法。

背景技术

现有的临床检测技术，主要是通过血清学肿瘤标志物和影像学方法进行检测。目前，临床上通常以使用检查血液中甲胎蛋白(AFP)含量、异常凝血酶原(DCP)，以及超声检查和CT检查为主。然而，这些检测方法分别具有如下一些明显的缺陷。血清学指标AFP和DCP，这两者灵敏度都较低，分别为不足60％和44％；而且，AFP水平也极易因怀孕或其他疾病等因素而升高，这将使得检测结果假阳性率偏高。此外，影像学诊断方法则对设备有较高依赖性，同时，操作者经验对其操作也会产生影响，极易出现漏诊。这将导致大部分患者在早期没有得到及时确诊而失去最佳治疗时期，失去了早发现早治疗的机会。

目前，研究已证实HCC患者血浆游离DNA羟基化(5hmC)检测，在HCC早期诊断中取得了令人振奋的进步，但是在实际操作中存在以下局限性：1、目前DNA羟甲基化的主要研究手段常为基于二代测序的方法，其操作繁琐，且测序费用昂贵；2、目前基于二代测序的检测方法，对测序深度要求较高，耗时较长，不易于患者尽快拿到诊断结果。

发明内容

(一)发明目的

为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种多重巢式PCR方法。本发明利用多重PCR和巢式PCR相结合，利用4种目的基因的基因标志物，设计全新的PCR引物，避免PCR过程中引物二聚体、发夹结构的形成，并使用外部引物和内部引物组合的两轮PCR方法，保证了PCR扩增的特异性；通过对4个目的基因的羟甲基化状态的高效检测，实现在较低测序深度下完成对基因标志物中5hmC含量的检测，从而大幅降低测序成本，成为一种高效率、低成本的肝癌早期诊断检测手段。

(二)技术方案

为解决上述问题，本发明提供了一种多重巢式PCR方法，包括4种目的基因LDAH、MSL2、LFNG、MAD1L1、GATAD2A、CASZ1、SUFU、RAD51B和CAMTA1的引物组；引物组包括内侧引物和外侧引物,其中内侧引物序列包含测序接头序列；

外侧引物的核酸序列包括：

1-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGCAAAGAGTCAGTG；

2-PCR-NGS-F1：TTCCCTTTGGCAGAGGCAGCAG；

3-PCR-NGS-F1：TTTGGTTGGAAGAGGAGGCT；

4-PCR-NGS-F1：AGGATGCCTGGAAAGAGTCAGTG；

R-short：CAAGCAGAAGACGGCATACGA；

内侧引物的核酸序列包括：

P5-1-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGCTTCCACTGGCTTCAGGACTGACGCC；

P5-2-PCR-NGS-F2：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCAGGCTTCAGCCCATGGAGCGGGTAG；