[发明专利]一种RNA文库的构建方法及试剂盒

说明书

本申请属于基因检测技术领域，具体公开一种RNA文库的构建方法，包括如下步骤：向片段化的总RNA中加入能够与rRNA特异性结合的探针，孵育，所述探针不带接头序列；加入逆转录体系进行第一次逆转录；加入带有接头序列的随机引物进行第二次逆转录，得到逆转录产物；加入连接引物和连接酶将所述逆转录产物进行连接，得到连接产物；加入扩增引物，对所述连接产物进行PCR扩增，得到所述RNA文库。本申请至少具有以下有益效果之一：本申请提供的构建方法通过先加入能够与rRNA特异性结合的探针，使探针与rRNA特异性地结合以封闭rRNA，使核糖体RNA无法进行扩增，从而达到了去除的目的。

技术领域

本申请属于基因测序技术领域，更具体地说，它涉及一种RNA文库的构建方法及试剂盒。

背景技术

转录组测序技术，RNA-seq是研究生物基因表达的重要工具，该技术广泛应用于不同物种的基因表达图谱分析中。近年来出现的RNA-seq建库试剂盒主要侧重于RNA链特异性研究，文库建库过程需要提取总RNA并富集mRNA，通过逆转录合成第一链cDNA，使用dUTP合成第二链cDNA，随后进行双链cDNA的末端补平、加腺嘌呤A碱基再进行接头连接，消化含尿嘧啶U碱基的cDNA后通过PCR扩增完成建库。

其具体的建库过程如下：

(1)添加dUTP合成双链cDNA，通过尿嘧啶U碱基区分链特异性；

(2)对cDNA进行末端补平修复及对cDNA的3’端加腺嘌呤A碱基，保证cDNA双链的3’端含有A碱基悬挂进而配合接头的3’端胸腺嘧啶T碱基实现TA连接完成建库；

(3)需要设计两条单链接头并退火形成双链，且含有硫代硫酸酯键修饰，保证接头T碱基不会脱落，才能进行有效接头连接；

(4)最后，在进行PCR之前还需对含有尿嘧啶U碱基的cDNA第二链进行消化才能实现链特异性建库。

在病原微生物的检测中，由于无法对病毒和原核生物进行mRNA富集，所以其中大量的片段为人源宿主的rRNA，通常比例在80-90%。此外，非人源的物种，真核和原核生物的核糖体区域保守性较高，物种间差异通常在个位数碱基，通常难以用于短片段进行物种的分型。因此，在病原微生物检测过程中，使用核糖体去除试剂盒，对核糖体进行特异性的探针结合，并使用RNaseH酶进行消化，反应结束后，使用DNaseI酶进行DNA探针消化，反应产物再进行磁珠纯化。

由于核糖体去除流程需要两次酶反应，并需要纯化后进行后续试验，整体流程需要1~2h，且成本较高；对设备和操作要求较高，如果反应不全，结果影响较大。

发明内容

为了降低成本，本申请提供一种RNA文库的构建方法，该方法通过将能够与rRNA特异性结合的探针先加入片段化的总RNA中，使探针与rRNA特异性地结合以封闭rRNA，使得对于探针以及随机引物的设计不再受到序列的限制，可以在保守区域设计探针，不用覆盖非保守区域，避免了物种间序列的差异导致的探针结合效果不佳，设计更加简单。

本申请是通过以下方案实现的：

本申请提供了一种RNA文库的构建方法，包括如下步骤：

向片段化的总RNA中加入能够与rRNA特异性结合的探针，孵育，所述探针不带接头序列；

加入逆转录体系进行第一次逆转录；

加入带有接头序列的随机引物进行第二次逆转录，得到逆转录产物；

加入连接引物和连接酶将所述逆转录产物进行连接，得到连接产物；

加入扩增引物，对所述连接产物进行PCR扩增，得到所述RNA文库。