[发明专利]一种化学培养体系及其应用

说明书

本发明公开了一种化学培养体系及其应用，所述化学培养体系包含基础培养基、小分子化合物，形成化学成分明晰的无血清培养体系。本发明大大提高了神经细胞培养活力及体外生存时间。本发明不采用目前广泛使用的使用含有动物源性成分的代血清B27及GS21，而使用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，成分明确，避免了血清及动物源性成分的存在带来的潜在危险，因此本发明大大拓展了神经细胞移植的临床前景。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种化学培养体系及其应用。

背景技术

神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、帕金森病（PD）、阿尔茨海默症（AD）等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴、神经核团毁损术或脑深部电刺激手术等治疗方法，但均不能达到很好的疗效，并且会带来“异动症”或是“药效波动”等严重影响生活质量的不良反应。

除神经退行性疾病之外，脊髓损伤（spinal cord injury ，SCI）是常见的一种神经系统创伤性疾病，据国外统计SCI患者一生的治疗康复费用平均达75万美元以上，美国每年对SCI患者的花费超过60亿美元。我国的患病率更是高于欧美发达国家，昂贵的治疗费用，长时间的康复治疗以及劳动力的丧失给个人及家庭带来的巨大影响，也给社会带来沉重的负担。

神经退行性疾病和脊髓损伤的治疗难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。目前，神经细胞的移植是最为有效的一种治疗方式。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。目前，神经干细胞的异体移植已经在临床上取得了一定的效果。部分临床试验采取神经系统细胞系移植方法，但现存的神经细胞系资源有限，多为神经系统肿瘤细胞系，且在建系过程中存在EB病毒带来的不稳定因素；而异体神经细胞由于体外传代不易，且异体神经干细胞由于伦理限制以及获得技术不便，这些因素都进一步阻碍了以上疾病的临床推进。近年来，胚胎干细胞及诱导多能干细胞技术（iPSC）的开展取得了很大的进展，利用这类细胞进行定向分化可以获得多种类型的成体细胞（Cell，2006，124(4)pp.663-676； Cell，2007，131(5)pp.861-872）。因此，使用包括胚胎干细胞及iPSC在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行神经细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了神经细胞在临床医学上的应用潜力。

从多能干细胞到神经干细胞，目前应用最为广泛的诱导方法有两种，第一种为两步法：首先细胞聚合成团形成拟胚体（embryonic bodies），之后细胞进一步被诱导成为神经元细胞。这种方法的缺点在于细胞分化不同步，且神经元细胞的纯度不高；此外，动物源性的生长因子的使用也制约了神经元细胞在临床上的使用。第二种为SMAD途径双重抑制法（Dual SMAD inhibition）（Nat Biotechnol，2009， 05；27(5)：485），该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGFB途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。通过这种方法，可以在血清类成分（Knockout Serum Replacement）的存在下得到诱导感觉神经元（Nat Biotechnol，2009，05；27(5)：485）。虽然可应用于移植的细胞种类大大增加，但是目前神经细胞的体外培养大多依赖血清成分的存在，例如胎牛血清和目前广泛使用的代血清B27系列（ThermoFisher），GS21（G0800, Sigma-Aldrich），这类代血清含有动物源性成分，因此存在一系列安全隐患，它们的存在大大限制了神经细胞移植的的临床应用。因此，不含有血清成分神经系统基础培养基的开发对于神经系统再生医学的发展至关重要。