[发明专利]一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字PCR检测试剂盒

说明书

本发明属于分子检测领域，尤其涉及一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字PCR检测试剂盒。首先公开了一种用于同时检测新型冠状病毒及其变异株的的引物探针组合物，所述新型冠状病毒包括野生型及B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株变异株；针对N基因、ORF1ab基因和S基因HV69‑70del、K417N、K417T、N501Y突变型进行所述引物探针组合物设计。本发明开发了一种新的多重数字PCR体系以及利用该PCR体系进行新型冠状病毒及其变异株检测的试剂盒。该多重数字PCR体系解决了现有的不同新型冠状病毒变异株需要分次单独检测，过程繁琐的问题。

技术领域

本发明属于分子检测领域，尤其涉及一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字PCR检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种单股正链RNA病毒，容易发生变异。在临床上，新冠病毒感染者的症状差异较大，从无症状到危重症都有可能发生。除了个体因素的差异外，病毒变异也可能是导致感染患者症状差异大的重要因素。研究表明，新型冠状病毒突变速率约为每月2～4个突变，目前在已知的株系发现了超过25个突变的变异株。相继在多个国家发现B.1.1.7新冠变异株、B.1.351新冠变异株和P.1新冠变异株，它们在病毒表面刺突蛋白的受体结合域(RBD)发生了突变，使其与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体更容易结合。发生在这些新冠病毒突变株刺突蛋白RBD的突变包括HV69-70del、K417N、K417T和N501Y突变等。病毒的变异会显著影响其传播能力和致病能力，甚至出现耐药问题而加大治疗难度。所以对病毒变异的监测极为重要，可以为防控疫情和治疗患者提供科学依据，以及为疫苗开发和药物靶点筛选等科学研究提供支持。

扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定SNP基因型。

现有新型冠状病毒变异株的检测采用扩增阻滞突变系统PCR法(ARMS-PCR)，qPCR-ARMS技术分别检测新冠病毒的S基因的HV69-70del、K417N、K417T、N501Y等，其中B.1.1.7变异株检测位点为HV69-70del和N501Y，B.1.351变异株检测位点为K417N和N501Y，P.1变异株检测位点为K417T和N501Y)。然而ARMS-PCR需要多次检测才能确定相应的亚型，且对样品需求量大。

发明内容

本发明公开了一种全新的检测新型冠状病毒变异株的方法，通过单次检测即可同时确定样品中是否具有新型冠状病毒以及区分野生型、B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种用于同时检测多种新型冠状病毒野生型及三种变异株的引物探针组合物，所述多种新型冠状病毒变异株包括B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株；针对N基因、ORF1ab基因和S基因HV69-70del、K417N、K417T、N501Y突变型进行所述引物探针组合物设计。

优选的，所述引物探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1-15所示的序列。

本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组合物。