[发明专利]肝脏类器官的制备方法

说明书

本申请公开一种肝脏类器官的制备方法，包括以下步骤：将脱细胞基质水凝胶、干细胞和肝脏细胞用无血清培养基混合均匀；在培养容器中静置培养至所述脱细胞基质水凝胶凝固；确定凝固后的所述脱细胞基质水凝胶中的细胞存活之后继续培养，获得肝脏类器官。通过本申请的方法所制备的肝脏类器官，其具有超低免疫源性，有跨物种移植的可能性。

本申请为专利申请“脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法及所制备的肝脏类器官”的分案申请，原申请的申请日为2020年8月28日，申请号为2020108879718，公开号为CN 112111444 A。

技术领域

本申请涉及一种细胞培养技术，尤其涉及一种肝脏类器官的制备方法。

背景技术

肝肿瘤通常需要进行肝脏大部分切除术，剩余肝脏将再生代偿，术后容易导致肝切除术后肝衰竭(PHLF)，这是最令人担忧的并发症之一，必须通过移植和终生免疫抑制来治疗。供体肝的短缺，高成本和免疫抑制限制了这种治疗方式的使用。肝功能衰竭的治疗也可以通过临时性肝支持方法来改善。比如生物人工肝，通过血浆置换和白蛋白透析进行持续性血液透析滤过可以改善某些肝功能参数，但是尚难以证明其能提高患者生存率。而且由于缺乏安全的肝细胞来源，这项技术受到了限制。肝细胞的潜在替代来源包括猪肝细胞，永生化人类肝细胞，ES细胞衍生的肝细胞和各种成人干细胞，但是仍不能解决现在人工肝治疗过程中原代肝细胞缺乏的问题。进一步地，有研究表明，间充质干细胞(MSCs)或MSCs来源的肝细胞样细胞移植可改善了啮齿动物或患有肝损伤的患者的肝功能。但是，迄今为止使用的几种传统方法收效甚微，这些类肝细胞样细胞仅表现出一部分标记和原代肝细胞的功能。

发明内容

本申请的目的是，克服现有技术的不足，提供一种简单、容易重复，重编程效率高，可用于临床上大量获取功能性肝脏细胞的脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，并利用所获得的肝脏细胞制备肝脏类器官。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

首先是一种脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法，其包括以下步骤：

获取脐带间充质干细胞；

对所述脐带间充质干细胞进行预处理2d；

利用成肝诱导组合物对经过预处理的脐带间充质干细胞进行成肝诱导7d；

利用第一成熟诱导组合物对经过成肝诱导处理的脐带间充质干细胞进行第一次成熟诱导7d，获得肝脏细胞；

利用第二成熟诱导组合物对所述肝脏细胞进行第二次成熟诱导12～20d，获得功能性肝脏细胞。

优选地，所述脐带间充质干细胞进行预处理之前，体外培养至对数生长期。

进一步优选地，所述脐带间充质干细胞进行预处理之前，在无血清条件下进行体外培养。

具体地，所述预处理的试剂包括20ng/mL的表皮生长因子和10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子；

所述成肝诱导组合物包括30ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL的肝细胞生长因子和0.61g/L的烟酰胺；

所述第一次成熟诱导组合物包括40ng/mL的ITS Premix的混合剂、10ng/mL的重组人骨保护素-M和1umol/L的地塞米松；

所述第二次成熟诱导组合物包括40ng/mL的ITS+Premix、40ng/mL的重组人骨保护素-M、1umol/L的地塞米松、10umol/L的人源γ分泌酶复合物抑制剂和10umol/L的小分子抑制剂SB431542。

光学显微镜下，所述功能性肝脏细胞为不规则圆形或多边形，核仁边界清晰。

所述功能性肝脏细胞的肝脏特异性基因表达率高于所述肝脏细胞。