[发明专利]肝脏类器官的制备方法

权利要求书

1.一种肝脏类器官的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

将脱细胞基质水凝胶、干细胞和肝脏细胞用无血清培养基混合均匀，每12ml无血清培养基中加入1×10⁷个干细胞、1×10⁶个肝脏细胞和3ml脱细胞基质水凝胶；所述脱细胞基质水凝胶通过脐带组织制备，所述干细胞为脐带间充质干细胞；所述肝脏细胞通过诱导脐带间充质干细胞分化获得；

在培养容器中静置培养至所述脱细胞基质水凝胶凝固；

确定凝固后的所述脱细胞基质水凝胶中的细胞存活之后继续培养，获得肝脏类器官；

其中，所述肝脏细胞通过诱导脐带间充质干细胞分化获得，包括成肝诱导过程和成熟诱导过程；所述成熟诱导过程包括：

利用第一成熟诱导组合物对经过成肝诱导处理的脐带间充质干细胞进行第一次成熟诱导7d，获得肝脏细胞；所述第一次成熟诱导组合物包括40 ng/mL的ITS Premix的混合剂、10 ng/mL的重组人骨保护素-M和1 umol/L的地塞米松；

利用第二成熟诱导组合物对所述肝脏细胞进行第二次成熟诱导12~20d，获得功能性肝脏细胞；所述第二次成熟诱导组合物包括40 ng/mL的ITS + Premix、40 ng/mL的重组人骨保护素-M、1 umol/L的地塞米松、10 umol/L的人源γ分泌酶复合物抑制剂和10 umol/L的小分子抑制剂SB431542；

所述成肝诱导过程之前，包括：

获取脐带间充质干细胞；

对所述脐带间充质干细胞进行预处理2d；所述预处理的试剂包括20 ng/mL的表皮生长因子和10 ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子；

所述成肝诱导过程包括：利用成肝诱导组合物对经过预处理的脐带间充质干细胞进行成肝诱导7d；

所述成肝诱导组合物包括30 ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL的肝细胞生长因子和0.61g/L的烟酰胺。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱细胞基质水凝胶使用前为预凝胶状态，使用时，用缓冲液配平为液态水凝胶。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预凝胶在冰上取用。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液态水凝胶进行混合之前调节pH到7~7.5。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在培养箱内进行所述静置培养。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过染色法确定所述脱细胞基质水凝胶中的重编程肝脏细胞和正常肝脏细胞存活的情况。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱细胞基质水凝胶中的细胞存活之后，继续培养6~7d，获得肝脏类器官。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获得肝脏类器官之后，将所述肝脏类器官移植到动物体内，当所述肝脏类器官在动物肝脏表面固定且布满血管，动物无免疫排斥反应，证明所述肝脏类器官移植成功。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞进行预处理之前，在无血清条件下进行体外培养，并且体外培养至对数生长期。