[发明专利]一种IL-4基因缺失斑马鱼

说明书

本发明涉及一种IL‑4基因缺失斑马鱼的构建，具体步骤包括CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计，靶位点序列为：5’‑GACCTGAAGATCTCAACATC‑3’；构建sgRNA体外转录载体；sgRNA体外转录、纯化及鉴定；制备Cas9mRNA；制备F₀代斑马鱼；将F₀胚胎饲养至性成熟；与野生型成鱼外交，筛选F₀；选取可产生有效突变的F₀自交，筛选F₁；从F₁代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F₂代；筛选IL‑4基因敲除纯合子即为稳定遗传的IL‑4基因缺失斑马鱼，本发明构建的IL‑4基因缺失斑马鱼可稳定遗传，IL‑4基因缺失斑马鱼可用于免疫相关疾病的研究。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种IL-4基因缺失斑马鱼。

背景技术

IL-4是一种免疫调节因子，能够调节T细胞分化、免疫球蛋白E的类别转换、巨噬细胞的分化成熟等多个免疫应答反应。IL-4/IL-4R调节在Th2免疫体系中起重要作用，将IL-4基因缺失，可以获得与免疫相关疾病的动物模型。

斑马鱼一次产卵量大，且体外受精，比小鼠的受精卵容易获得，实验操作简单，成本低，且斑马鱼IL-4/IL-4R体系与人类体系作用相近，斑马鱼还具有个体小，饲养成本低、用药量少、可以高通量筛选药物的优点，因此，制作IL-4基因缺失斑马鱼模型，具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是构建一种IL-4基因缺失斑马鱼。

本发明的制备过程如下：

本发明靶位点DNA序列为：5’-GACCTGAAGATCTCAACATC-3’(Seq No.1)。

本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为5’-ACCGGACCTGAAGATCTCAACATCG-3’(Seq No.2)，5’-AAACGATGTTGAGATCTTCAGGTCG-3’(SeqNo.3)，使用该试剂盒可以用于IL-4基因表达的沉默。

本发明提供了一种基因敲除方法，所述方法的步骤如下：利用所述的Oligo片段识别目的基因的靶位点，与Cas9结合并识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行剪切，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。

进一步的，所述靶点为一个或以上。

根据本发明的又一个方面，本发明提供一种IL-4基因缺失斑马鱼的制备方法，所述制备方法包括：

1.将sgRNA和Cas9 mRNA共同导入斑马鱼中；

2.培养获得稳定遗传的IL-4基因缺失斑马鱼。

在本发明的具体实施方案中，所述sgRNA的获得步骤如下：

1.确定IL-4基因敲除的靶位点；

2.根据步骤1确定的靶位点序列设计扩增引物，PCR获得sgRNA的体外转录模板；

3.根据步骤2获得的模板进行体外转录。

作为本发明的具体实施例，所述sgRNA的获得步骤如下：

1.查询斑马鱼IL-4基因的基因序列，根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计靶位点；