[发明专利]D-氨基酸氧化酶突变体及其在制备L-草铵膦中的应用

说明书

本申请涉及D‑氨基酸氧化酶突变体及其在制备L‑草铵膦中的应用。所述D‑氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D‑氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时，所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列包含对应于第62位和/或第226位的氨基酸残基的替换，所述第62位和第226位是参照SEQ ID NO.1限定的，并且所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少90％的同一性。

技术领域

本申请涉及生物技术领域；特别地，本申请涉及D-氨基酸氧化酶突变体，所述D-氨基酸氧化酶突变体在制备L-草铵膦中的用途，以及一种利用所述D-氨基酸氧化酶突变体制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(又名双丙氨膦、草丁膦，商品名包括保试达、百速顿等，英文名为phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)是德国赫斯特公司(现属于拜耳公司)在20世纪80年代开发的一种低毒、高效、非选择性触杀型有机磷除草剂。草铵膦作用于植株后可以抑制谷氨酰胺合成酶，从而中断植物体内谷氨酸的可逆反应，造成代谢紊乱，使植物堆积过量的氨而中毒，同时导致植物无法合成叶绿素从而光合作用受到抑制，导致植物死亡。草铵膦主要用于果园、马铃薯田、非耕地等，用于防治一年生和多年生的禾本科及双子叶杂草，如马唐、狗尾草、野小麦；多年生的禾本科杂草和莎草，如羊茅、鸭芽等。

灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦，但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法需要使用价格昂贵的手性拆分剂(例如奎宁)，拆分的步骤非常繁琐(例如需要经历成盐、诱导结晶、解盐等步骤)，并且拆分的理论收率只有50％，这导致此路线的工业价值比较低。

化学合成法包括不对称合成法和天然氨基酸手性源法等，其缺点包括需要用到昂贵的贵金属和配体或起始原料或反应路线需要剧毒物质或反应合成路线较长等。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下两类：(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体；(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得，主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。

除了这两种传统的生物催化法，以D,L-草铵膦为原料的去消旋合成方法凸显了巨大的成本优势。由于市售的草铵膦为D,L-草铵膦，其工业化生产技术已十分成熟，去消旋合成方法直接以D,L-草铵膦为原料，简单易得，成本较低，能够较好对接现有草铵膦工业生产体系。

发明内容

本申请基于D-氨基酸氧化酶突变体的鉴定，这些突变体可用于改进L-草铵膦的生物酶法生产。