[发明专利]一种仿生纳米探针及其制备方法和应用

说明书

一种仿生纳米探针及其制备方法和应用，属于生物纳米材料制备与应用领域；本发明的方法是先通过冻融法制备海胆式双重适配体金纳米粒子探针，随后将该仿生探针加入到血液样品中进行对目标CTC的识别与标记，然后对样品进行离心重悬清洗，最后将样品通入电感耦合等离子体质谱仪和培养孔板中进行单细胞检测和荧光成像分析。本发明的方法制备的仿生双重适配体金纳米粒子探针应用于单循环肿瘤细胞的在线检测方面，荧光性能好，作为纳米荧光探针具有良好的应用前景。新型的单个CTC在线二维检测方法，使用高效识别的海胆式双重适配体金纳米粒子探针，通过高检测效率电感耦合等离子体质谱的时间分辨检测模式和荧光成像进行单个CTC的在线分析。

技术领域

本发明属于生物纳米材料制备与应用领域，具体涉及一种修饰荧光基团的双重适配体金纳米粒子探针及其制备方法和应用。

背景技术

癌症，即恶性肿瘤，是100多种相关病症的统称，对生命体致死率极高，至今仍未攻克，因此成为当今分析化学、生物化学、医学研究的重点。研究表明，高达90％的癌症相关死亡是由转移性癌症引起的，即恶性肿瘤细胞从原病灶脱落，进入外周血，并发生向其他组织器官转移扩散，造成病情进一步恶化，甚至死亡。这些进入血液发生转移的恶性肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)。目前肿瘤诊断很大程度上依赖于组织切片的形态特征。但由于其准确性差、早期诊断能力差，导致传统方法逐渐由解剖病理学向分子病理学转变。CTCs作为一类新的分子病理学临床生物标记物被广泛研究。例如，患者血液中CTCs的筛查，可以作为恶性肿瘤细胞早期发现、预后、复发识别的信息来源。

研究表明，大量群体CTCs分析可能会丢失不同单个细胞的重要信息，因为不同CTC之间具有细胞异质性。因此对单个CTC的进一步分子和药理分析可以为肿瘤细胞的基因组成、发病机制和耐药模式的更多信息提供有力支撑，同时也为癌症患者发生癌细胞转移的个性化治疗提供帮助。另一方面，由于给定容量血液中CTCs含量是极为稀缺的，每毫升血液中有数百万个血球细胞，却仅有10～100个循环肿瘤细胞，这样低的样品丰度为CTCs的选择性分离和检测带来了技术上的挑战，同时也印证了从单细胞角度分析CTC的重要性。

一般而言，检测生物样品中CTCs的方法主要包括CellSearch技术、生物捕获界面-成像技术、质谱分析技术等。但是这些方法往往存在样品消耗量高、检测效率低、操作复杂、无法进行在线单细胞分析等问题，并且常用的抗体纳米探针材料在生物样品中容易降解。因此，我们提出了新型的单个CTC在线检测方法，使用高效识别的海胆式双重适配体金纳米探针以及高检测效率电感耦合等离子体质谱的时间分辨检测模式进行单个CTC的在线分析。该方法简单方便、成本低、耗时短、样品消耗量少，便于临床检测及分析。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种新型仿生的生物纳米粒子探针及其制备方法，同时还提供所述探针在检测单个循环肿瘤细胞方面的应用。本发明方法制得的探针能够显著提升电感耦合等离子质谱单细胞检测效率，并且通过二维验证，甚至可以检测到少量生物样品中的单一稀有细胞，极大提升珍贵样品利用率，并根据结果进行单细胞分析，为初步的肿瘤筛选、细胞功能分析及亚组分类提供理论和方法依据。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种仿生纳米探针，其为双重适配体金纳米粒子探针，所述的双重适配体为两种不同的适配体，具体为Sgc8和SYL3C；该两种适配体的序列分别为：Sgc8：5’thiol-C6-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-6-FAM；SYL3C：5’thiol-C6-TTTTTTTTTTCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AMCA。(对Sgc8适配体来说，5’端修饰巯基，3’端修饰荧光基团6-FAM；对SYL3C适配体来说，5’端修饰巯基，3’端修饰荧光基团AMCA；A为脱氧腺嘌呤核苷酸，T为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，C为脱氧胞嘧啶核苷酸，G为脱氧鸟嘌呤核苷酸。)