[发明专利]一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒，属于兽医生物诊断技术领域。本发明提供的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ IDNO.8所示，其实现了对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的同时、定量检测，该检测方法灵敏度高，特异性好，适用于临床样品的检测。

技术领域

本发明属于兽医生物诊断技术领域，尤其涉及一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒。

背景技术

新生犊牛腹泻是临床上常见的一种疾病，对犊牛身体健康造成严重危害，是造成奶牛产业经济损失的重要原因之一。引起犊牛腹泻的病原有很多，包括病毒、细菌和寄生虫，其中病毒主要有牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)、牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)和牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)等，且呈世界性流行。牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科瘟病毒属，是单股正链RNA病毒，感染该病毒的牛主要表现为腹泻、黏膜发绀、消化道粘膜糜烂、免疫耐受和持续性感染等，BVDV自然感染对象是奶牛和黄牛，该病毒引起一种接触性传染病-牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine viral diarrhoea/mucosal disease,BVD/MD，危害严重。牛冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为不分段的单股正链RNA病毒，是引起犊牛腹泻和呼吸道感染的重要病原，感染BCoV的犊牛主要表现为腹泻，也可导致成年牛冬痢，呼吸道感染引起牛肺炎等。牛轮状病毒是呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起犊牛腹泻的重要病原，患病牛以排水样稀粪为主要特征，且多可引起继发感染。牛传染性鼻气管炎病毒可引起牛一种急性、热性、接触性传染病，感染该病毒的牛主要表现为呼吸道症状，也是引起牛肠炎型腹泻的重要病原之一，患病牛有时可出现带血性腹泻，新生犊牛可表现为全身性疾病。

随着我国科学技术的不断发展，人民生活水平不断提高，养殖业也不断扩大，由BVDV、BCoV、BRV和IBRV四种病毒引起的犊牛腹泻疾病严重影响着奶牛的健康，给我国奶牛产业带来了很大的影响，造成了巨大的经济损失。对于这四种病毒引起的疾病尚无有效的治疗药物和预防措施，欧洲国家采取尽快检出、淘汰患病牛以根除疾病。目前检测方法主要依赖于病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验、间接免疫荧光技术(IFA)、普通PCR技术和实时荧光定量PCR检测技术等。但这些试验方法存在周期较长、检测量较低、费用高、操作复杂、特异性不好等缺点，因此我们迫切需要建立一种快速、灵敏、稳定且同时能检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV四种病毒的多重荧光定量PCR检测方法，为临床检测提供一种快速、有效的检测技术。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重SYBRGreen I荧光定量PCR引物组。

本发明的目的之二在于提供一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重SYBR Green I荧光定量PCR方法。

本发明的目的之三在于提供一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的试剂盒。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR引物组，所述引物组包括4对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示：

BVDV-F：5'-ACAGGGCAGTCGTCAGTG-3'(SEQ ID NO.1)

BVDV-R：5'-TTCGTAGCAGTCGGTTGG-3'(SEQ ID NO.2)

BCoV-F：5'-AGTTTGAATTTGCAGAGGGACA-3'(SEQ ID NO.3)