[发明专利]一种假性慢病毒载体高效感染人脐带间充质干细胞的方法

说明书

本发明涉及人间充质干细胞和基因治疗技术领域，具体是一种假性慢病毒载体高效感染人间充质干细胞的方法，本发明使用人脐带间充质干细胞与携带荧光报告蛋白的假性慢病毒颗粒，先制成小体积的细胞和病毒混合液，进行单细胞状态下的短时间小体积悬浮感染；然后于最低限度培养液体积中继续培养至感染完成。本发明极大地提高了假性慢病毒成功感染人脐带间充质干细胞的效率，为假性病毒载体高效感染对促感染试剂敏感的靶细胞提供了一种方案。此外，本发明将假性慢病毒载体感染人脐带间充质干细胞的时长较之现有技术缩短50％以上，节省了时间成本，方便操作。

技术领域

本发明涉及人间充质干细胞和基因治疗技术领域，具体是一种假性慢病毒载体高效感染人脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)是一种分布广泛的多能性干细胞，具有自我更新和分化能力，在合适的条件下能分化为脂肪细胞、内皮细胞、肝细胞、肌细胞、骨细胞、胰腺细胞等多种终末细胞类型。分离间充质干细胞的组织来源很广泛，迄今为止已从骨髓、脂肪、肌肉、牙髓、滑膜、脐带、胎盘、羊膜、真皮、脐血等组织器官中分离获得了间充质干细胞。尽管不同来源的间充质干细胞在分子特征和疾病治疗潜力上有所差异，但各种来源的间充质干细胞都表达 CD73、CD90和CD105三种表面标记物，并且在标准培养条件下呈贴壁生长状态。间充质干细胞不仅具有易获取、大规模培养扩增、可冻存、无伦理学问题等特点，而且其细胞表面低表达主要组织相容性复合物和共刺激因子，从而使异体间充质干细胞移植治疗疾病时安全性很高。鉴于间充质干细胞上述优点，间充质干细胞不仅在临床前动物模型中能改善糖尿病、心肌梗死、神经退行性病变、肾病、骨关节炎、皮肤病等多种疾病，而且在部分临床人体实验中其安全性和有效性都得到了验证。人间充质干细胞用于治疗血管闭塞性动脉炎、急性心肌梗死、克罗恩病并发肛瘘和软骨损伤的“细胞药”产品已经获批上市。间充质干细胞通过分化、免疫调节、抗凋亡、抗氧化等多种途径发挥其疾病治疗效果，而且在不同疾病环境中其主要效应方式是不一样的。间充质干细胞通过细胞间直接接触或旁分泌方式改善疾病状态，并且越来越多的研究表明间充质干细胞治疗疾病主要经其旁分泌因子传递介导。

由于间充质干细胞移植不会转移自身遗传物质给受体器官组织，间充质干细胞可以作为基因编辑技术的细胞载体将基因编辑疗法高效地应用在难以治愈的疾病上。相比质粒瞬时转染引起的短暂基因表达变化，携带特定基因编辑序列的假性病毒载体感染人源干细胞由于长时间改变靶基因表达进而能维持基因和细胞治疗的长有效期，近年来渐渐成为介导基因修饰最常用的手段之一。然而，假性病毒载体编辑人源干细胞的现有技术方法存在感染率不高和耗时长等诸多问题，限制了基因编辑联合人源干细胞治疗疾病的广泛使用。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种假性慢病毒载体高效感染人脐带间充质干细胞的方法，极大地提高了假性病毒载体感染人间充质干细胞的效率，扩展了基因编辑联合人间充质干细胞治疗疾病的应用潜能和可行性。

本发明提出的技术方案如下：一种假性慢病毒载体高效感染人脐带间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

S1：传代培养人脐带间充质干细胞，制备成单细胞状态的人脐带间充质干细胞悬液；

S2：将所述人脐带间充质干细胞与携带绿色荧光报告蛋白的假性慢病毒颗粒按数目比值先后加入EP管，制成小体积的细胞病毒混合液；

S3：培养箱悬浮培养1小时所述细胞病毒混合液，孵育期间定期吹打混匀所述细胞病毒混合液，进行短时间小体积悬浮感染；

S4：转移所述细胞病毒混合液至细胞培养皿，加入适量的人脐带间充质干细胞培养基，使所述细胞病毒混合液达到最低限度培养液体积，即培养皿所需正常培养液量的60％，继续培养至感染完成。

S5：在使用该方法进行感染时，可在人脐带间充质干细胞接触假性病毒颗粒期间添加促感染试剂。

由于是通过小体积悬浮培养的方式完成本发明，故将本发明提出的方法简称为小体积策略。