[发明专利]一种基于减毒流感病毒载体的新型冠状病毒肺炎疫苗

权利要求书

1.一种减毒流感病毒株，其特征在于，所述病毒株的基因组中包含外源性抗原基因序列，其中，所述外源性抗原基因序列嵌合在所述减毒流感病毒株的NA基因的5’端，与NA基因和其两端的包装信号序列（packaging sequence）共同组成一抗原表达盒；

所述抗原表达盒从5’端-3’端具有式I所示结构：

Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5（I）

其中，

各“-”独立地为化学键或核苷酸连接序列；

Z0为NA基因序列的5’端非编码区序列；

Z1为NA基因的5’端编码区包装信号序列，其序列如SEQ ID NO：5所示；

Z2为外源性抗原基因序列；

Z3为连接肽序列或无；

Z4为包含5’端编码区包装信号序列的NA基因全长序列，其序列如SEQ ID NO：4所示；

以及

Z5为NA基因序列的3’端非编码区序列；

并且，所述外源性抗原基因序列来源于SARS-CoV-2，其编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述病毒株的基因组中还含有截短的流感病毒NS1蛋白基因序列。

2.如权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述截短的流感病毒NS1蛋白为流感病毒NS1蛋白C末端102个氨基酸缺失的蛋白。

3. 如权利要求2所述的病毒株，其特征在于，所述截短的流感病毒NS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.如权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述减毒流感病毒株比其对应的减毒前流感病毒株的毒性减少了80-100倍。

5. 如权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述减毒流感病毒株是保藏号为CCTCCNO:V202115的减毒流感病毒载体新冠肺炎疫苗候选株。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括：

(a) 第一表达载体，所述第一表达载体含有用于表达所述的外源性抗原的第一表达盒；

所述的第一表达盒从5’端-3’端具有式II所示结构：

Z0’-Z1’-Z2’-Z3’-Z4’-Z5’（II）

其中，

各“-”独立地为化学键或核苷酸连接序列；

Z0’为NA基因序列的5’端非编码区序列；

Z1’为NA基因的5’端编码区包装信号序列，其序列如SEQ ID NO：5所示；

Z2’为外源性抗原基因序列，所述外源性抗原基因序列来源于SARS-CoV-2，其编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

Z3’为连接肽序列或无；

Z4’为包含5’端编码区包装信号序列的NA基因全长序列，其序列如SEQ ID NO：4所示；

以及

Z5’为NA基因序列的3’端非编码区序列；

(b) 第二表达载体，所述第二表达载体含有用于表达截短的流感病毒NS1蛋白的第二表达盒；所述截短的流感病毒NS1蛋白为流感病毒NS1蛋白C末端102个氨基酸缺失的蛋白；

其中，所述的第一表达载体和第二表达载体是同一载体或不同的载体。

7.一种制备如权利要求1-5任一项所述的减毒流感病毒株的方法，包括以下步骤：

(i) 构建外源性抗原基因cDNA序列嵌合在流感病毒NA基因cDNA序列的5’端的重组表达质粒V1，以及流感病毒NS1基因C末端102个氨基酸截短的重组表达质粒V2；

(ii) 分别获得包含流感病毒PA、PB1、PB2、HA、NP和M基因的六种辅助质粒；

(iii) 分别将步骤(i)中构建的重组表达质粒V1和V2，以及步骤(ii)中获得的六种辅助质粒共转染宿主细胞，培养48小时后，收集培养上清液；和

(iv) 将所述上清液接种SPF鸡胚后，收获鸡胚尿囊液即获得所述减毒流感病毒株。

8.一种如权利要求1-5任一项所述的减毒流感病毒株的用途，其特征在于，用于制备一疫苗组合物，所述疫苗组合物用于病毒感染性疾病。