[发明专利]一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒

说明书

本发明属于生物分子检测技术领域，涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒。发明通过设计与现有引物序列不同的内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，并加入了2条成环引物LoopF和LoopB，大幅缩短了核酸扩增反应的时间，采用本发明设计的特异性引物，最佳反应温度为65℃恒温，最佳反应时间为30分钟，相比原有的核酸扩增反应所需时间至少缩短了一半以上。同时，基于本发明设计的6条引物，由于其具有高度的特异性，只需根据扩增反应产物有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断，可以快速实现核酸检测，完全满足了当前HIV‑1核酸检测的需要。

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是诱发人获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)的主要病原体，在分类学上属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒属(Lentivirus)。

近年来，国内外主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR、细胞培养等方法检测HIV-1抗体或病毒。这些方法都不同程度的存在一些缺点。

如ELISA法操作程序较复杂，易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染，试验时间较长，需要两个小时以上才能得出检测结果。同时必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便。

细胞培养是一种无菌操作技术，要求具备很高的实验工作环境和条件，例如无菌操作间、超净工作台等)；需要大量的实验设备，例如培养箱、离心机、显微镜等；需要大量的专业实验器材，实验技术复杂；需要有经验的技术人员操作，且实验周期很长，不适宜疾病的快速检测。凝集试验包括明胶颗粒(PA)和乳胶颗粒(LAT)属于半定量测定，需多次倍比稀释测定费试剂，且结果重复性差，且灵敏度低。

普通的PCR技术虽然在灵敏度和特异性方面有优势，但是在技术应用上也有几点限制：第一，PCR技术需要昂贵的实验仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很高温度下的DNA模板的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变化几十个循环之后实现模板量的放大。第二，由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，加大仪器研制的成本。第三，在PCR循环中每一个循环引物退火的时间都很短(几秒到几十秒)这就要求PCR体系必须有过量的PCR引物。而过量的引物会与模板错配，错误引发扩增，引物二聚体等等，进而抑制PCR扩增，特别是在初始模板量低的情况会使这种现象加剧。

与传统PCR技术相比，等温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时等温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。等温扩增技术日益受到重视。

常见的等温扩增技术有以下几种：滚环等温扩增(RCA)，环介导等温扩增(LAMP)，依赖解旋酶等温扩增(HDA)等。该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒等温条件下进行靶序列高效扩增，可合成10⁹-10¹⁰个数量级的靶标DNA。该技术避免了常规PCR对循环温度的特殊要求，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，并因其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点提升了它的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物。