[发明专利]一种神经干细胞的培养基和培养方法

说明书

本发明提供了一种神经干细胞的培养方法：将原代神经干细胞传代2‑4次后，获得神经干细胞球；消化获得细胞悬液接种于包被贴片剂的培养器皿中贴壁培养，传代5‑10次，获得单层神经干细胞；消化获得细胞悬液进行悬浮培养，传代2‑4次获得神经干细胞球；然后按照贴壁培养‑悬浮培养循环进行。本发明还提供了一种用于神经干细胞贴壁培养的培养基包括：含10% BIT 9500的基础培养基中添加bFGF 20ng/mL，EGF 20ng/mL，L‑谷氨酰胺 1‑2mM，BIP‑V5 1‑10μM，Blebbistatin 1‑5μM。本发明提供了的培养方法和培养基，适用于多种动物和人的多种来源的神经干细胞，能够在超过20代的长期培养的条件下，保持神经干细胞的良好的自我更新和分化能力不下降，提供的干细胞同质化程度高，可适用于神经损伤修复等方面的科学研究。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，涉及一种神经干细胞扩增培养方法。

背景技术

神经退行性疾病是一种大脑和脊髓细胞神经元结构和功能丧失的疾病状态，影响人的记忆功能和运动功能，其病因和发病机制尚不明确。神经元不可再生，一旦损害不可恢复。目前临床上对神经退行性疾病的治疗仅是通过少数几种药物延缓其发病的病程，治疗其缓解症状。神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）是来源于神经系统或者能够形成神经组织；具有自我更新能力；能通过不对称分裂产生不同于自身细胞的细胞。神经干细胞具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。鉴于神经退行性疾病由于神经元不可逆的损害，神经干细胞治疗成为该疾病近几年来备受关注的治疗手段。研究表明，直接将NSCs移植入受损小鼠损伤区域后，能明显减少神经凋亡，改善神经系统的运动功能，促进损伤区域的恢复，明显改善由神经元丢失所导致的认知功能障碍。

目前，国外已有神经干细胞移植应用于小儿脑瘫和脊髓侧索硬化症。干细胞移植往往需要大量的细胞，这就要求必须具备成熟的体外培养干细胞技术，同时保证干细胞在体外培养环境下保持其细胞学特性并可分化为合适的细胞类型。由于神经干细胞在血清环境中会很快分化为神经元和神经胶质细胞，目前体外培养神经干细胞主要采用无血清体系悬浮培养获得神经干细胞球。采用悬浮培养法能够获得非常高的培养密度，增殖能力也能够保持较长时间，适于大规模体外培养。但是悬浮培养法存在以下问题：一是原代培养接种密度大且细胞容易分化；二是神经干细胞球在应用是还需要进行消化，消化后的神经干细胞自我更新能力下降严重；三是神经干细胞球是一个异质性结构，表现在神经球之间的异质性和单个神经球内细胞的异质性，使得悬浮培养神经干细胞无法量化和大批培养后的实际神经干细胞量要远低于理论数量。为了获得同质性更高的神经干细胞越来越多的研究开始采用贴壁培养的方式，但是贴壁培养的方式需要使用贴片剂包被的培养器皿，但是贴片剂的使用对神经干细胞的长期扩增有不利影响，主要表现在长期培养后增殖能力的下降和干性降低、分化。随着细胞治疗手段的推广对用于临床前研究的干细胞制剂标准愈加严格，需要一种适于临床应用、细胞同质化程度高且能够长期保持增殖能力的神经干细胞培养方法。

发明内容

针对目前的神经干细胞培养方法同质化程度低和长期增殖能力差的问题，本发明提供一种神经干细胞扩增培养方法，通过改善培养基成分能够使神经干细胞长期主要以单层细胞培养的方式生长，且不降低其增殖能力并且保持干性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种神经干细胞的培养方法，包括以下步骤：

（1）将原代神经干细胞接种并悬浮培养，待神经干细胞球生长至合适大小进行传代，传代2-4次后，收集神经干细胞球；

（2）将神经干细胞球制备神经干细胞悬液，然后接种于包被贴片剂的培养容器中培养，细胞生长至一定融合度进行传代，传代5-10次，获得单层神经干细胞；

（3）将单层神经干细胞制备神经干细胞悬液并接种并悬浮培养，待神经干细胞球生长至合适大小进行传代，传代2-4次后，收集神经干细胞球；

（4）按照步骤（2）、（3）循环培养。