[发明专利]一种神经干细胞的培养基和培养方法

权利要求书

1.一种神经干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将原代神经干细胞接种并悬浮培养，待神经干细胞球生长至合适大小进行传代，传代2-4次后，收集神经干细胞球；

（2）将神经干细胞球制备神经干细胞悬液，然后接种于包被贴片剂的培养容器中培养，细胞生长至一定融合度进行传代，传代5-10次，获得单层神经干细胞；

（3）将单层神经干细胞制备神经干细胞悬液并接种并悬浮培养，待神经干细胞球生长至合适大小进行传代，传代2-4次后，收集神经干细胞球；

（4）按照步骤（2）、（3）循环培养。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述原代神经干细胞为试验动物胚胎脑组织中分离培养获得，通过人或动物的胚胎干细胞诱导培养获得或人或动物的其他干细胞诱导培养获得；所述人的胚胎干细胞选自商业化的人胚胎干细胞系；

所述贴片剂选自多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、层粘连蛋白和纤维连接蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述神经干细胞球的平均直径为100-120μm；所述融合度为80%-90%；所述接种密度为（1-2）×10⁴/cm²。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述悬浮培养的培养基中含有bFGF和/或EGF；优选的，所述悬浮培养的培养基中bFGF浓度为10-40ng/mL，EGF浓度为10-40ng/mL。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述贴壁培养的培养基包括以下成分：含10%体积分数的BIT 9500的基础培养基中添加bFGF 20ng/mL，EGF 20ng/mL，L-谷氨酰胺 1-2mM，BIP-V5 1-10μM，Blebbistatin 1-5μM；

所述基础培养基选自DMEM/F-12培养基或体积比为1:1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基。

6.一种根据权利要求1-5任一所述培养方法获得的神经干细胞。

7.一种用于神经干细胞贴壁培养的培养基，其特征在于，包括以下成分：

含10%体积分数的BIT 9500的基础培养基中添加bFGF 20ng/mL，EGF 20ng/mL，L-谷氨酰胺 1-2mM，BIP-V5 1-10μM，Blebbistatin 1-5μM。

8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM/F-12培养基或体积比为1:1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的混合培养基。

9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于，用KnockOut DMEM/F-12培养基代替DMEM/F12培养基。

10.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述培养基中还包括抗菌剂。